豬腺病毒3型PCR檢測方法的建立及Hexon基因克隆分析.pdf

1、豬腺病毒3型(Porcine adenovirus3，PADV-3)是豬腺病毒中最常見的一種血清型，主要引起豬群腹瀉。1964年Haig首次從英格蘭腹瀉仔豬直腸拭子中分離到該病毒，隨后在澳大利亞、美國、加拿大、西班牙、中國等國家相繼被報道。目前，由于對PADV-3研究較少，在該病毒結構和功能、診斷方法、流行病學、致病性等方面均有待深入系統(tǒng)研究。
　　本研究根據GeenBank中登陸的PADV-3 E1B基因序列(登錄號:AB026

2、117)，利用Primer5.0軟件設計兩對特異性引物，預計擴增片段大小分別為247 bp和194bp。經條件優(yōu)化，成功建立了針對PADV-3 PCR檢測方法和熒光定量PCR檢測方法，兩種方法的特異性和重復性較好，且均具有較高靈敏度，分別最低可檢3.7×105拷貝/μL和3.1×102拷貝/μL。應用本研究建立的常規(guī)PCR開展PADV-3感染情況調查，對從四川省部分地區(qū)收集的283份糞便樣品進行檢測。結果顯示，PADV-3總陽性率為7.

3、07％(20/283)，非腹瀉豬群PADV-3陽性率為3.31％，腹瀉豬群中PADV-3陽性率為9.87％，顯著高于非腹瀉豬群。應用所建實時熒光定量PCR開展PADV-3感染組織特性研究，對8頭PADV-3感染陽性仔豬相應組織器官進行采樣檢測。結果顯示，腸粘膜、腸系膜淋巴結、肺、扁桃體中PADV-3含量分別為2.24×104～6.42×105拷貝/mg、9.49×103～7.36×104拷貝/mg、5.59×103～1.65×105拷貝

4、/mg和9.93×103～1.89×105拷貝/mg，病毒含量顯著高于其它組織器官。
　　根據GenBank中PADV-3 Hexon基因序列（登錄號:AC000189）設計兩對引物。以陽性病料DNA為模板，分段擴增克隆，經測序分析，得到Hexon全基因序列（登錄號:KU761583）。利用生物信息學軟件對所獲PADV-3 Hexon全基因進行分析。結果顯示，所獲Hexon全基因為2799 bp，編碼932個氨基酸，理論分子質量為

5、105653.8 u，理論等電點為5.23;該蛋白不穩(wěn)定指數為42.92，屬不穩(wěn)定蛋白;且同一氨基酸的不同密碼子的選擇上存在一定的偏向性。該蛋白最大疏水指數和最小疏水指數分別為2.289和-3.011，表現(xiàn)一定疏水性;氨基酸中無信號肽切割位點，推測該蛋白缺乏信號肽。Hexon蛋白含有25個絲氨酸、18個蘇氨酸、21個絡氨酸激酶磷酸化位點和35個抗原位點。將PADV-3克隆株（SCMS01株）與參考株的Hexon基因核苷酸序列進行同源性分