Wt1及Wnt-β-catenin通路調(diào)控足細(xì)胞發(fā)育及損傷修復(fù)研究.pdf

1、目的:
　　探討轉(zhuǎn)錄因子Wt1及Wnt/β-catenin信號(hào)通路在腎小球足細(xì)胞發(fā)生發(fā)育及損傷修復(fù)中的作用及其分子機(jī)制。
　　材料與方法:
　　1.顯微分離胚齡E13.5 d、E14.5 d、E15.5 d、E16.5 d、E17.5 d、E18.5 d胎鼠腎臟和出生后P1 d、P7 d、P14 d及P28 d小鼠腎臟。采用基因芯片技術(shù)篩選 Wnt/β-catenin信號(hào)通路在足細(xì)胞發(fā)育過程中的差異表達(dá)基因；通過免疫組

2、織化學(xué)技術(shù)觀察小鼠足細(xì)胞發(fā)育不同時(shí)間點(diǎn)Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵分子活化的β-catenin蛋白表達(dá)的定位與定量；應(yīng)用實(shí)時(shí)定量 RT-PCR技術(shù)對(duì)小鼠足細(xì)胞中 Wt1 mRNA及β-catenin mRNA表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析；采用Western blotting技術(shù)觀察足細(xì)胞發(fā)育過程中活化的β-c atenin蛋白的表達(dá)水平變化。
　　2.在33℃條件下通過RPMI1640培養(yǎng)液誘導(dǎo)條件永生化小鼠足細(xì)胞系增殖，在37℃

3、條件下誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞逐漸分化成熟；設(shè)計(jì)并合成靶向Wt1的小分子干擾RNA(Small Interfering RNA，siRNA)，待足細(xì)胞分化成熟后利用JetPRIMETM進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染；分別應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)與Western blotting技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染組Wt1 mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化從而判斷 Wt1沉默效率；采用上述分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步觀察小鼠足細(xì)胞 Wnt/β-catenin通路相關(guān)分子和足細(xì)胞nephrin

4、表達(dá)水平變化；通過MTT技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)沉默Wt1的表達(dá)后足細(xì)胞活力變化情況。
　　結(jié)果:
　　1.基因芯片結(jié)果表明，Wnt4、Wnt6及DKK1等在小鼠足細(xì)胞發(fā)育不同時(shí)間點(diǎn)存在表達(dá)差異。這些差異表達(dá)基因功能分屬于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程、基因轉(zhuǎn)錄與翻譯、酶調(diào)節(jié)活性、抗氧化活性等。實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果顯示，Wt1 mRNA的表達(dá)在E13.5 d至E15.5 d時(shí)，其表達(dá)水平逐漸增加，在出生后1天（P1 d）其表達(dá)水平明顯增加，隨后直至

5、足細(xì)胞發(fā)育成熟其表達(dá)量逐漸減少；β-catenin mRNA的表達(dá)在E13.5 d至E15.5 d時(shí)亦逐漸增加，其在E16.5 d時(shí)的表達(dá)水平開始下降，隨后其表達(dá)水平直至足細(xì)胞發(fā)育成熟后均無明顯變化；Wes tern b lo tting結(jié)果表明，活化的β-catenin蛋白的表達(dá)水平在E14.5 d時(shí)達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，在P1 d時(shí)再次出現(xiàn)小高峰，隨后其表達(dá)量逐漸下降并維持在低水平。免疫熒光結(jié)果顯示，活化的β-c atenin在足

6、細(xì)胞發(fā)育的起始階段表達(dá)量較高，隨著足細(xì)胞發(fā)育成熟，其表達(dá)逐漸減少，在發(fā)育成熟的足細(xì)胞中，其不表達(dá)或表達(dá)量較少。
　　2.實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western blotting結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，特異性沉默足細(xì)胞Wt1的表達(dá)可誘導(dǎo)Wnt1 mRNA和Wnt1蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)（P<0.05），β-catenin mRNA及蛋白表達(dá)水平未見明顯變化，但β-catenin的磷酸化水平明顯減少（P<0.05）。MTT結(jié)果表明 Wt1表達(dá)下調(diào)會(huì)

7、導(dǎo)致足細(xì)胞活力受損，可能與nephrin的表達(dá)減少（P<0.05）有關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.轉(zhuǎn)錄因子Wt1及Wnt/β-catenin通路的表達(dá)在小鼠足細(xì)胞發(fā)生發(fā)育過程中的存在時(shí)間與空間表達(dá)差異，這種特異性的時(shí)空表達(dá)對(duì)于腎臟尤其是足細(xì)胞的正常發(fā)育是至關(guān)重要的。在足細(xì)胞發(fā)育早期，Wnt/β-catenin通路參與啟動(dòng)足細(xì)胞發(fā)育過程，隨著足細(xì)胞逐漸發(fā)育成熟，其表達(dá)逐漸減少并處于靜止?fàn)顟B(tài)。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，siR

8、NA技術(shù)特異性沉默足細(xì)胞Wt1基因的表達(dá)可減少足細(xì)胞內(nèi)β-c aten in的磷酸化水平，從而使β-catenin的降解減少。提示W(wǎng)t1的表達(dá)下調(diào)可誘導(dǎo)Wnt/β-catenin通路的異常激活。此外，本研究尚發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞 Wt1表達(dá)下調(diào)可伴有足細(xì)胞活力受損，可能與Wnt/β-catenin通路激活后誘導(dǎo)足細(xì)胞裂孔隔膜分子nephrin的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。
　　3.我們通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) Wt1可能對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路具有負(fù)