七厘散促組織工程皮膚修復(fù)創(chuàng)面及龍血素A對(duì)毛囊干細(xì)胞Wnt-β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控.pdf

1、目的：建立高效穩(wěn)定的大鼠毛囊干細(xì)胞(hair follicle stem cells，F(xiàn)SCs)和毛囊成纖維細(xì)胞原代取材、分離、培養(yǎng)方法，并對(duì)所得細(xì)胞進(jìn)行鑒定。制備七厘散含藥血清，將七厘散含藥血清加入FSC培養(yǎng)體系中，明確其對(duì)FSC增殖的促進(jìn)作用。選用皮耐克作為組織工程皮膚支架，將毛囊成纖維細(xì)胞與皮耐克支架復(fù)合構(gòu)建人工真皮，再將FSC與人工真皮共培養(yǎng)，構(gòu)建組織工程皮膚。制作裸鼠全層皮膚缺損模型，將構(gòu)建的組織工程皮膚移植入皮膚創(chuàng)面，探討七

2、厘散對(duì)FSC組織工程皮膚修復(fù)創(chuàng)面的影響。由于七厘散復(fù)方藥物成分復(fù)雜，為了進(jìn)一步探討中藥有效成分在FSC修復(fù)皮膚創(chuàng)面中的作用機(jī)理，本研究選用七厘散中君藥血竭的主要活性成分----龍血素A單體干預(yù)FSC，探討其對(duì)FSC生長(zhǎng)及細(xì)胞周期的影響，并進(jìn)一步檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路中主要蛋白和下游基因表達(dá)的變化，初步探討龍血素A對(duì)FSC增殖或定向分化的分子機(jī)制。
　　方法：采用“兩步酶”消化法獲取乳鼠觸須部皮膚FSC，毛囊成纖維細(xì)

3、胞采用組織塊法培養(yǎng)，免疫熒光檢測(cè)培養(yǎng)的FSC中角蛋白15(cytokeratin15，CK15)、角蛋白19(cytokeratin19，CK19)、β1整合素的表達(dá)以及毛囊成纖維細(xì)胞中纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、層粘連蛋白(laminin，LN)、波形蛋白(Vimentin)的表達(dá)。嚴(yán)格遵循“通法”制備大鼠七厘散含藥血清。噻唑藍(lán)(3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-

4、H-tetrazolium bromide，MTT）法探究不同時(shí)間點(diǎn)、不同體積百分比七厘散含藥血清作用于FSC后的細(xì)胞活性。將毛囊成纖維細(xì)胞接種于皮耐克真皮支架構(gòu)建真皮，表面種植5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)標(biāo)記的FSC，Transwell雙層培養(yǎng)板進(jìn)行氣-液界面培養(yǎng)，構(gòu)建FSC組織工程皮膚。制作裸鼠背部皮膚缺損模型后將動(dòng)物隨機(jī)分為A、B組，A組用生理鹽水預(yù)處理創(chuàng)面，B組用七厘散預(yù)處理創(chuàng)面

5、，然后各動(dòng)物創(chuàng)面均移植構(gòu)建的FSC組織工程皮膚。移植后再將每組動(dòng)物隨機(jī)分為5小組，分別對(duì)移植處創(chuàng)面進(jìn)行生理鹽水、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)陽(yáng)性藥物、七厘散內(nèi)服、七厘散外用、七厘散內(nèi)服+外用方式處理。每日觀察并記錄創(chuàng)面大體愈合情況，制訂評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)得分。于移植后3d、5d、7d、14d在原創(chuàng)面處取材，標(biāo)本作病理學(xué)和免疫熒光組織化學(xué)檢測(cè)。MTT法探究不同時(shí)間點(diǎn)、不同濃度龍血素A對(duì)FSC增殖的影響

6、。流式細(xì)胞儀檢測(cè)龍血素A對(duì)FSC細(xì)胞周期的影響。Western Blot、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)技術(shù)對(duì)龍血素A干預(yù)的FSC胞質(zhì)內(nèi)β-catenin、糖原合成激酶（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）蛋白以及核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子3(transcription factor3，Tcf3)、淋巴增強(qiáng)因

7、子1(lymphoid enhancerfactor，Lef1)、c-myc、cyclin D1基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：“兩步酶”法分離、培養(yǎng)的細(xì)胞為圓形或多角形，典型鋪路石狀，呈CK15、CK19、β1整合素表達(dá)陽(yáng)性;組織塊法獲得的細(xì)胞為紡錘形，F(xiàn)N、LN、Vimentin表達(dá)陽(yáng)性。連續(xù)灌胃3d、體積百分比為2.5％的七厘散含藥血清作用于FSC24h的促增殖效果最佳。毛囊成纖維細(xì)胞與皮耐克復(fù)合，連續(xù)培養(yǎng)5d，構(gòu)建的真皮無(wú)

8、污染，細(xì)胞生長(zhǎng)良好。將FSC與人工真皮復(fù)合后繼續(xù)培養(yǎng)5d，再進(jìn)行氣-液界面培養(yǎng)5d后，得到的人工皮膚復(fù)合物質(zhì)地柔軟，有一定的韌性和彈性。FSC組織工程皮膚移植后，各組動(dòng)物生存狀態(tài)良好，創(chuàng)面無(wú)感染、出血，移植物無(wú)脫落，亦無(wú)明顯的免疫排斥反應(yīng)。術(shù)后3d創(chuàng)面逐漸縮小，血痂形成。術(shù)后5d血痂逐漸變硬，變厚。術(shù)后7d痂面面積慢慢變小，痂面周緣可見新生皮膚。術(shù)后14d大部分裸鼠血痂脫落，其中A、B兩組中七厘散外用組和七厘散內(nèi)服+外用組血痂脫落較其余

9、組早。術(shù)后14d，A、B兩組中七厘散外用組和七厘散內(nèi)服+外用組裸鼠創(chuàng)面已上皮化，移植處新生皮膚較厚，質(zhì)地柔軟，呈白色或粉膚色，可與正常皮膚相區(qū)別。通過(guò)觀察創(chuàng)面愈合情況，制訂評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，半定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示術(shù)后3d，A、B兩組平均得分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明七厘散預(yù)處理創(chuàng)面在愈合早期能抑制創(chuàng)面出血、減輕炎癥反應(yīng)、促進(jìn)創(chuàng)面結(jié)痂，對(duì)促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)有積極作用;A、B兩組各用藥組與生理鹽水對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明在移植后早期，不同的用藥方式對(duì)傷

10、口的愈合有影響。術(shù)后5d，創(chuàng)面進(jìn)入修復(fù)期，兩組修復(fù)狀況無(wú)明顯差別。術(shù)后7d和14d，A、B兩組平均得分差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中B組七厘散外用組、七厘散內(nèi)服+外用組平均得分最高，顯示外用和內(nèi)服+外用為七厘散最佳用藥方式。病理學(xué)結(jié)果顯示，術(shù)后3d各組炎性反應(yīng)明顯，創(chuàng)面有血痂覆蓋，可見未降解的皮耐克支架與大量淋巴細(xì)胞，七厘散外用組創(chuàng)面細(xì)胞增多密集。術(shù)后5d各組炎癥反應(yīng)減輕，各組表皮細(xì)胞開始增生，但未完全覆蓋創(chuàng)而，新生上皮與真皮連接不緊密，容易

11、分離，B組肉芽組織增生明顯。術(shù)后7d各組炎癥反應(yīng)明顯減輕，膠原纖維增多，創(chuàng)緣可見較厚新生表皮。術(shù)后14d各組未見明顯支架材料，A、B兩組中生理鹽水對(duì)照組和七厘散內(nèi)服組有少量創(chuàng)面未愈合，其余各組創(chuàng)面均愈合，表皮和真皮分層明顯，分化良好。免疫熒光檢測(cè)顯示，術(shù)后各組中BrdU標(biāo)記的FSC呈CK15、 CK19和β1整合素陽(yáng)性表達(dá)，隨著移植時(shí)間的延長(zhǎng)，各組標(biāo)本中角蛋白14(cytokeratin14，CK14)的表達(dá)均逐漸增多增強(qiáng)。MTT結(jié)果顯

12、示20μg/mL龍血素A作用于FSC24h的促增殖效果最佳，流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，龍血素A作用后，S期和G2期細(xì)胞數(shù)量增加，龍血素A促進(jìn)細(xì)胞向S期和G2期轉(zhuǎn)變。龍血素A干預(yù)FSC后，Wnt經(jīng)典通路中GSK-3β表達(dá)減少，β-catenin表達(dá)增多，核內(nèi)Tcf3、Lefl、c-myc和cyclin D1基因的mRNA表達(dá)均上調(diào)。
　　結(jié)論：七厘散含藥血清能促進(jìn)FSC的增殖。七厘散通過(guò)“祛瘀生肌”，改善創(chuàng)面微環(huán)境，促進(jìn)FSC組織工程皮膚