轉化生長因子-β1降低大鼠自發(fā)性癲癇發(fā)作并抑制膠質細胞活化.pdf

1、目的:轉化生長因子-β1(TGF-β1)已被證實對多種腦損傷疾病所致的神經(jīng)元損傷具有直接的神經(jīng)保護作用,但是外源性的TGF-β1在對由匹羅卡品所致的癲癇持續(xù)狀態(tài)引起的的自發(fā)性癲癇發(fā)作、膠質細胞活化增生、神經(jīng)元死亡和苔蘚纖維發(fā)芽的作用仍不甚明了。我們通過運用新型、無創(chuàng)、有效的經(jīng)鼻給藥途徑,繞開血腦屏障直接將TGFβ1遞送到大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,觀察TGF-β1對大鼠慢性期自發(fā)性反復癲癇發(fā)作的抑制作用并探討其可能的內在抗癲癇形成機制。

2、　　方法:健康雄性SD大鼠隨機平均分為正常對照組(Control, n=25),匹羅卡品模型組(Pilo-group, n=25),和TGF-β1治療組 (TGF-β1 group, n=25)。TGF-β1組大鼠經(jīng)鼻腔給予重組人TGF-β1,同時Pilo-組及Control組分別經(jīng)鼻給予相同容量的PBS溶液,24小時之后通過匹羅卡品腹腔注射建立癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus, SE)模型,SE 后 50min,腹腔

3、注射 10％水合氯醛 350mg/kg 終止發(fā)作。SE 建立后7d,分別取各組大鼠5只放入特定籠子中,通過12小時動態(tài)視頻觀察其活動,記錄其自發(fā)性癲癇發(fā)作的次數(shù)、發(fā)作等級及持續(xù)時間,3w后觀察結束,后斷頭取腦,采用冰凍切片經(jīng)Timm染色觀察苔蘚纖維發(fā)芽(Mossy fiber sprouting,MFS)的情況。余下老鼠分別于不同的固定時間點斷頭取腦,通過膠質纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,

4、GFAP)和離子鈣結合接頭分子1(Ionized calcium binding adaptor molecule 1,Iba1)免疫組化觀察癲癇大鼠海馬組織膠質細胞的活化,采用尼氏(Nissl)染色法觀察海馬區(qū)存活的神經(jīng)元數(shù)目。
　　結果:1.TGF-β1抑制自發(fā)性癲癇發(fā)作:Control組大鼠生長良好,未觀察到任何癲癇發(fā)作;Pilo組大鼠在癲癇持續(xù)狀態(tài)后第9d時首次記錄到自發(fā)性癲癇發(fā)作;TGF-β1治療組大鼠在SE后第12d首

5、次出現(xiàn)自發(fā)性發(fā)作;并且TGF-β1治療組大鼠癲癇平均每日發(fā)作次數(shù)、等級分數(shù)及持續(xù)時間均較Piol組有明顯減少。
　　2.TGF-β1抑制癲癇大鼠海馬區(qū)活化膠質細胞的過度激活。Control組大鼠海馬膠質細胞有基礎表達,數(shù)量較少,星形膠質細胞形態(tài)學表現(xiàn)為胞體較薄,周圍突起較少;小膠質細胞數(shù)量也較少,形態(tài)學表現(xiàn)為胞體較薄,周圍有大量樹枝狀突起;在匹羅卡品模型組大鼠海馬區(qū)膠質細胞明顯增加,激活的星形膠質細胞形態(tài)學亦發(fā)生改變表現(xiàn)為:胞體肥

6、大,突起增大增粗,并可能出現(xiàn)極化等并伴有功能學改變;激活的小膠質細胞形態(tài)學為胞體肥大變圓,周圍突起減少,變短增粗,意味著吞噬作用的激活。TGF-β1組大鼠海馬區(qū)活化的膠質細胞數(shù)較Pilo-組相比見有顯著降低,14d時最明顯,基本降至正常水平。
　　3.TGF-β1抑制神經(jīng)元死亡:為明確TGF-β1是否能有效阻止匹羅卡品所致的神經(jīng)元死亡,我們利用Nissl染色方法觀察海馬CA3區(qū)存活神經(jīng)元的數(shù)目。Control組大鼠海馬區(qū)錐體細胞未

7、見明顯丟失,Pilo-組在SE后顯示出有大量神經(jīng)元丟失,SE后14d最明顯;但TGF-β1治療組Nissl染色存活神經(jīng)元較Pilo組相比有明顯增多,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。
　　4.TGF-β1抑制匹羅卡品所致癲癇大鼠苔蘚纖維發(fā)芽。我們通過Timm染色方法觀察TGF-β1是否具有抑制癲癇苔蘚纖維發(fā)芽的作用。結果:Control組大鼠海馬CA3區(qū)分子層未見明顯的Timm染色顆粒;Pilo組大鼠在海馬CA3區(qū)Timm染色顆粒

8、呈連續(xù)密集分布,并深入錐體細胞之間;TGF-β1組大鼠海馬CA3區(qū)見不連續(xù)的、散在分布的Timm染色顆粒,說明TGF-β1具有抑制異常的苔蘚纖維發(fā)芽的作用。
　　結論:經(jīng)鼻給予TGF-β1可以顯著降低癲癇大鼠慢性期自發(fā)性重復性癲癇發(fā)作的頻率、發(fā)作程度及持續(xù)時間,同時抑制了膠質細胞的過度活化,并有效阻止了癲癇所引起的神經(jīng)元死亡和苔蘚纖維發(fā)芽;其潛在的抗癲癇形成的內在機制可能與抑制膠質細胞過度活化有關。同時經(jīng)鼻腔給藥作為一種全新、簡單