兩種BH3擬似物增強(qiáng)5-FU對(duì)人大腸癌細(xì)胞敏感性作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　大腸癌(colorectal cancer，CRC)是世界第三常見(jiàn)惡性腫瘤。5-FU是治療大腸癌的重要化療藥物之一。雖然以5-FU為基礎(chǔ)的化療方案已經(jīng)成為治療大腸癌的重要途徑，然而由于固有和獲得性耐藥問(wèn)題導(dǎo)致僅有約25％的患者對(duì)5-FU治療有效。雖然合用如奧沙利鉑等藥物能夠增強(qiáng)5-FU的臨床療效，但這些療法往往伴隨著明顯的不良反應(yīng)并有約一半患者死亡。因此目前仍然迫切需要發(fā)展新的治療策略以增強(qiáng)5-FU抗腫瘤效果。

2、　　BH3擬似物(BH3-mimetics)是以Bcl-2家族抗凋亡蛋白為靶點(diǎn)的小分子化合物。BH3擬似物通過(guò)破壞Bcl-2家族抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白間的由BH3結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。近年來(lái)，棉酚、apogossypol、ABT-737、ABT-263、TW-37、obatoclax、HA14-1等BH3擬似物已成為研究的熱點(diǎn)。多項(xiàng)試驗(yàn)表明BH3擬似物能夠通過(guò)恢復(fù)高水平表達(dá)Bcl-2家族抗凋亡蛋白的腫瘤細(xì)胞正常凋亡途徑增強(qiáng)傳

3、統(tǒng)化療敏感性。如棉酚可以提高紫杉醇對(duì)人類前列腺癌PC-3細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。醋酸棉酚和地塞米松合用可明顯增強(qiáng)后者促凋亡活性。棉酚同吉西他濱合用可以逆轉(zhuǎn)高水平表達(dá)Bcl-2蛋白的細(xì)胞株對(duì)吉西他濱的耐藥。在患者接受環(huán)磷酰胺-阿霉素-長(zhǎng)春新堿-潑尼松龍(CHOP)方案治療前給予棉酚可獲得比單獨(dú)應(yīng)用CHOP方案或者棉酚更好的療效。此外，棉酚被證明可增強(qiáng)地塞米松對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞、環(huán)磷酰胺和美羅華對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤移植瘤的治療作用。這些研究表明，棉酚同

4、與其他藥物合用可以提高細(xì)胞毒效應(yīng)，因此將棉酚同常見(jiàn)化療藥物合用于治療耐藥的腫瘤可能是一種新策略。BH3I-2'是一種人工合成的結(jié)構(gòu)與Bak BH3肽鏈相似的小分子BH3擬似物。多項(xiàng)研究表明BH3I-2'通過(guò)同Bcl-2、 Bcl-XL結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。BH3I-2'也可增強(qiáng)某些抗腫瘤藥物的敏感性。研究表明BH3I-2'可增加死亡受體5單克隆抗體TRA-8對(duì)乳腺癌細(xì)胞的治療作用。BH3I-2'能增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏

5、感性。BH3I-2還可增強(qiáng)阿霉素和蛋白酶體抑制劑硼替佐米對(duì)Bcl-2蛋白過(guò)表達(dá)甲狀腺腫瘤細(xì)胞的敏感性。
　　本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)研究?jī)煞NBH3擬似物（棉酚、BH3I-2'）能否增加5-FU對(duì)大腸癌細(xì)胞的敏感性及探討相關(guān)機(jī)制為大腸癌治療提供新的策略和方法，同時(shí)進(jìn)一步揭示BH3擬似物抗腫瘤作用的機(jī)理，為BH3擬似物用于腫瘤的治療提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1、采用MTT法測(cè)定5-FU、棉酚和BH3I-2'對(duì)細(xì)胞增殖抑制作

6、用。
　　2、采用流式細(xì)胞術(shù)(PI單染法)進(jìn)行細(xì)胞周期解析及凋亡判定。
　　3、采用Lipofectamine2000試劑進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。
　　4、采用Westemblot檢測(cè)PARP、caspase-3，8，9、cyclin A、 cyclin D1、cyclin E、mTOR、p-mTOR、S6K1、p-S6K1、TS和TP蛋白的表達(dá)。
　　5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間差異采

7、用Student's t-test分析。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、MTT法測(cè)得棉酚作用于三種大腸癌細(xì)胞24小時(shí)和48小時(shí)的IC50值，HT-29細(xì)胞為44.22±1.02μmol/L和26.11±1.04μmol/L; HCT116細(xì)胞為24.92±1.08μmol/L和14.11±1.08μmol/L; RKO細(xì)胞為31.25±1.04μmol/L和21.83±1.05μmol/L;以不同濃度BH3I

8、-2'作用于HCT116細(xì)胞24小時(shí)和48小時(shí)，以MTT法測(cè)得IC50值分別為107.5±1.27μmol/L和65.16±1.07μmol/L。不同濃度棉酚作用于HT-29細(xì)胞、RKO細(xì)胞和HCT116細(xì)胞48小時(shí)后，流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示隨著濃度增加亞二倍體凋亡峰(sub-G1峰)逐漸明顯，細(xì)胞凋亡率逐漸增高，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸增高。不同濃度棉酚作用于HT-29細(xì)胞、RKO細(xì)胞和HCT116細(xì)胞24小時(shí)后，westernblo

9、t法分析結(jié)果顯示隨著濃度增加凋亡相關(guān)蛋白PARP，caspase3，8，9裂解逐漸增多，細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)水平逐漸降低而細(xì)胞周期蛋白A和細(xì)胞周期蛋白E表達(dá)水平無(wú)明顯改變。不同濃度BH3I-2作用于HCT116細(xì)胞24小時(shí)后，以westernblot法檢測(cè)結(jié)果顯示隨著濃度增加凋亡相關(guān)蛋白PARP、caspase3，8活化裂解程度逐漸增高，細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)水平逐漸降低而細(xì)胞周期蛋白A和細(xì)胞周期蛋白E表達(dá)水平無(wú)明顯改變。
　　2、

10、分別以20μg/ml5-FU和20μmol/L棉酚作用于HT-29細(xì)胞，4μg/ml5-FU和10μmol/L棉酚在作用于HCT116細(xì)胞，2μg/ml5-FU和10μmol/L棉酚，4μg/ml5-FU和40μmol/L BH3I-2作用于HCT116細(xì)胞48小時(shí)，MTT法分析結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組細(xì)胞活力明顯低于各單藥組。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組亞二倍體凋亡峰(sub-G1峰)及G0/G1期細(xì)胞比例明顯高于各單藥組。Westem

11、blot法分析結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組凋亡相關(guān)蛋白PARP、caspase3活化裂解程度明顯高于各單藥組。此外，聯(lián)合用藥組細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)水平逐漸降低而細(xì)胞周期蛋白A和細(xì)胞周期蛋白E表達(dá)水平無(wú)明顯改變。
　　3、Westemblot法分析結(jié)果顯示棉酚及BH3I-2'均以濃度依賴的方式下調(diào)大腸癌細(xì)胞TS蛋白表達(dá)水平。同時(shí)二者均能顯著逆轉(zhuǎn)5-FU誘導(dǎo)TS蛋白表達(dá)增多以及下調(diào)5-FU活性代謝產(chǎn)物氟尿嘧啶脫氧核苷(5-FdUMP)與TS、四

12、氫葉酸共同形成的三元絡(luò)合物水平。以瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA法沉默TS蛋白表達(dá)可以增強(qiáng)單藥5-FU或者聯(lián)合用藥組誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡作用。單藥棉酚，BH3I-2'或者同5-FU聯(lián)合用藥均對(duì)TP蛋白表達(dá)無(wú)明顯作用。
　　4、Westernblot法分析結(jié)果顯示棉酚及BH3I-2'單獨(dú)應(yīng)用或者同5-FU聯(lián)合應(yīng)用均可下調(diào)HCT116細(xì)胞和RKO細(xì)胞mTOR和S6K1蛋白磷酸化水平。 mTOR經(jīng)典抑制劑雷帕霉素可顯著地下調(diào)HCT116細(xì)胞和R

13、KO細(xì)胞mTOR和S6K1蛋白磷酸化水平以及細(xì)胞周期蛋白D1和TS蛋白表達(dá)，而對(duì)TP蛋白、細(xì)胞周期蛋白A、細(xì)胞周期蛋白E表達(dá)水平?jīng)]有明顯影響，此作用同棉酚及BH3I-2'作用相似。
　　結(jié)論：
　　1、棉酚、BH3I-2'均以時(shí)間和濃度依賴性方式抑制大腸癌細(xì)胞增殖。棉酚及BH3I-2'均可通過(guò)激活內(nèi)源性和外源性凋亡途徑誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡。棉酚及BH3I-2'均可通過(guò)下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)水平引起細(xì)胞周期阻滯。
　　2

14、、棉酚、BH3I-2'均可通過(guò)增強(qiáng)5-FU誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯作用增強(qiáng)5-FU對(duì)大腸癌細(xì)胞敏感性。
　　3、棉酚、BH3I-2'均可通過(guò)下調(diào)TS蛋白表達(dá)水平增強(qiáng)5-FU誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡作用。
　　4、棉酚、BH3I-2'無(wú)論是否同5-FU聯(lián)合用藥均不影響TP蛋白表達(dá)水平。
　　5、棉酚、BH3I-2'通過(guò)負(fù)性調(diào)控mTOR/S6K1通路下調(diào)TS蛋白和細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)作用。
　　6、棉酚、BH3I-2'通