長鏈非編碼RNA-UCA1對大腸癌細(xì)胞放射敏感性的影響及其機(jī)制初探.pdf

1、目的：采用高通量測序篩選可能與大腸癌放射敏感性相關(guān)的長鏈非編碼 RNA(Long noncoding RNA，LncRNA)，研究其對大腸癌細(xì)胞放射敏感性的影響及其機(jī)制。
　　方法：（1）大腸癌輻射抵抗細(xì)胞株CCL244和大腸癌輻射敏感細(xì)胞株HCT116經(jīng)6Gy X射線輻照后，通過lncRNA芯片技術(shù)篩選出X射線照射前后差異表達(dá)的lncRNA。（2）通過實(shí)時定量PCR技術(shù)檢測lncRNA-UCA1在大腸癌組織及大腸癌細(xì)胞中的表達(dá)。

2、（3）設(shè)計合成并篩選出該lncRNA-UCA1最有效的siRNA干擾序列。（4）siRNA轉(zhuǎn)染CCL244細(xì)胞并聯(lián)合6Gy X射線照射處理后，通過噻唑藍(lán)比色法（MTT）、克隆形成實(shí)驗、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、劃痕實(shí)驗及Western Blot實(shí)驗分別檢測細(xì)胞活力、增殖能力、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期分布、細(xì)胞遷移能力以及凋亡相關(guān)蛋白Caspase3和Bcl-2、遷移相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白ZEB1和Vime

3、ntin蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：（1）LncRNA芯片測序結(jié)果顯示大腸癌輻射抵抗細(xì)胞株CCL244經(jīng)過X射線照射后lncRNA-UCA1表達(dá)水平升高最為明顯，而輻射敏感細(xì)胞株HCT116經(jīng)照射前后lncRNA-UCA1表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異（2）32對臨床組織樣本中，與癌旁組織相比，腫瘤組織中l(wèi)ncRNA-UCA1相對表達(dá)水平為33.24±0.26，P<0.001，其中有78.13％的患者lncRNA-UCA1表達(dá)水平相對升高；4對

4、接受新輔助放化療前后的患者臨床樣本中，放療后組織中 lncRNA-UCA1相對于放療前呈現(xiàn)高表達(dá)；與正常的腸上皮 FHC細(xì)胞相比，lncRNA-UCA1在大腸癌HCT116、CCL244、SW480、LOVO細(xì)胞中相對高表達(dá)。（3）三條干擾序列分別轉(zhuǎn)染 CCL244細(xì)胞后，使用實(shí)時定量 PCR檢測lncRNA-UCA1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)siRNA-2的干擾效果最佳，干擾抑制率為57%(P<0.001)。（4）下調(diào)CCL244細(xì)胞中l(wèi)ncRNA

5、-UCA1表達(dá)聯(lián)合6Gy X射線處理后，與單純照射組相比，細(xì)胞活力明顯下降（P<0.001），平均致死劑量（D0）值分別為1.01Gy和1.69 Gy，準(zhǔn)閾劑量（Dq）值分別為1.91Gy和2.71Gy，放射增敏比SER為1.67，說明下調(diào)UCA1可以增加CCL244細(xì)胞的放射敏感性；下調(diào)lncRNA-UCA1表達(dá)聯(lián)合6Gy X射線處理后，與單純照射組相比，細(xì)胞凋亡率上升明顯，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001)，凋亡相關(guān)蛋白 Cas

6、pase-3表達(dá)水平上升，Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降，同時G2/M期細(xì)胞比例降低，G2期阻滯情況得以緩解，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；下調(diào) lncRNA-UCA1表達(dá)后，CCL244細(xì)胞的遷移能力受到抑制(16.06±1.30)% vs(35.92±1.63)%，P<0.05，遷移相關(guān)蛋白 MMP2、MMP9和 EMT相關(guān)蛋白 ZEB1、Vimentin的表達(dá)水平均降低。
　　結(jié)論：大腸癌輻射抵抗細(xì)胞株CCL244經(jīng)X射線照