RNA干擾靶向抑制PI3K p85α表達(dá)對(duì)5-FU誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、大腸癌(colorectal carcinoma,CRC)是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在世界不同地區(qū)差異很大,以北美、大洋州最高,歐洲居中,亞非地區(qū)較低。我國(guó)南方,特別是東南沿海明顯高于北方,發(fā)病率儀次于胃癌、食管癌。近20多年來,世界上多數(shù)國(guó)家大腸癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì),據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì),世界上大腸癌的發(fā)病率正以每年2％的速度上升,在我國(guó)隨著經(jīng)濟(jì)的進(jìn)步,生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的變化,尤其是高脂肪、高蛋白、高熱量、低纖維素的飲食,我國(guó)的大

2、腸癌發(fā)病率每年也快速遞增,特別是大城市上升趨勢(shì)更為顯著,據(jù)上海的調(diào)查顯示,我國(guó)大腸痛發(fā)病率的增速是世界平均水平的兩倍,達(dá)到年均增加4％。然而,大腸癌的治療效果并不理想,大腸癌傳統(tǒng)治療方法,即外科手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)藥物治療方法的不斷發(fā)展和完善,在延長(zhǎng)患者生存期和提高患者生存質(zhì)量方面取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步；但是手術(shù)和放療足局部治療,難以控制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,化療雖為全身性治療,但組織選擇性和特異性差,毒副作用明顯。FOLFOX方案是國(guó)內(nèi)外認(rèn)

3、可的大腸癌化療方案,其中臨床最為常用的是“5-氟尿嘧啶+亞葉酸鈣+鉑類”,但近年來臨床上頻有報(bào)道大腸痛對(duì)5-FU的耐藥現(xiàn)象,為了保證治療效果,臨床多推薦使用多種化療藥物聯(lián)合,但化療藥物缺乏組織選擇性和特異性,對(duì)骨髓等高代謝正常人體重要器官和組織產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用,反而不僅影響了患者的生存質(zhì)量,還增加了患者精神壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此,探尋大腸上皮細(xì)胞癌變、演化和轉(zhuǎn)移的機(jī)制,早期發(fā)現(xiàn)和干預(yù)大腸癌的生物學(xué)進(jìn)程,以及增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性

4、,從而減輕化療藥物帶來的副作用,對(duì)大腸癌的治療具有重要的意義。
　　 近年來,3-磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)和AKT通路逐漸引起了人們的關(guān)注。P13K-AKT信號(hào)通路作為細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一,參與增值、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多利-細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。3-磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)家族成員屬于原癌基因,是一種

5、可使肌醇環(huán)第三位羥基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶,已發(fā)現(xiàn)三種PI3K同工酶。近年來發(fā)現(xiàn),IA型PI3K和其下游分子蛋白激酶(PI3K/Akt信號(hào)通路)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),該通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活,其活性異常不僅能導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化,而且與腫瘤細(xì)胞的遷移、粘附、腫瘤血管生成以及細(xì)胞外基質(zhì)的降解等相關(guān)。在PI3K家族中,研究最廣泛的是能被細(xì)胞表面受體所激活的IA型PI3K,哺乳動(dòng)物細(xì)胞中IA型PI3K從酪氨酸激酶連接受體傳遞信號(hào),IA型

6、PI3K是由p85a/β/γ(調(diào)節(jié)亞基)和p110a/β/δ/γ(催化亞基)組成的異二聚體,研究表明,PI3K/Akt通路中的組成成分廣泛的人類腫瘤普中表達(dá)失調(diào),特別是PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85a在現(xiàn)有的研究中均顯示出其在大腸癌細(xì)胞中突變的比率較高,本課題組已通過免疫組化方法證實(shí)了在正常腸粘膜組織、大腸息肉、大腸腺唐、大腸癌組織中p85a表達(dá)呈上升趨勢(shì),PI3K p85a的表達(dá)水平與大腸癌的演進(jìn)成顯著正相關(guān)關(guān)系,并且相關(guān)關(guān)系非常密切,提示

7、PI3K p85a在大腸痛演化過程中可能起重要作用,而且還進(jìn)一步證實(shí)PI3K p85a表達(dá)水平和大腸癌的惡性程度有關(guān),PI3K p85a的表達(dá)水平與大腸痛的Dukes分期成顯著正相關(guān)關(guān)系。PI3K通過兩種方式激活,一種是通過調(diào)節(jié)亞基p85a與具有磷酸化酪氨酸殘基的生長(zhǎng)因了受體或連接蛋白相互作用,引起二聚體構(gòu)象改變而被激活；另一種是通過Ras和p110直接結(jié)合導(dǎo)致PI3K的活化。PI3K激活的結(jié)果是在質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使PIP3,PIP3作

8、為一種配體把含有PH結(jié)構(gòu)域的蛋白聚集到細(xì)胞膜上,使它們被膜上激酶磷酸化,激活的蛋白可以引起下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在PIP3作用的眾多底物中,最引人關(guān)注的是AKT,即細(xì)胞內(nèi)反轉(zhuǎn)錄病毒v-AKT的同源物。AKT作為蛋白激酶,它對(duì)細(xì)胞生存機(jī)制和抗凋亡的調(diào)控是通過對(duì)一系列底物的磷酸化而完成的。AKT能直接磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子,通過調(diào)控這些轉(zhuǎn)錄因子可以抑制凋亡基因的表達(dá)和增強(qiáng)抗凋亡基因的表達(dá),從而促進(jìn)細(xì)胞的存活。前者的一個(gè)典型例子是轉(zhuǎn)錄因子Forkh

9、ead蛋白家族。它的三個(gè)成員FoxO1、FKHRL1和AFX都含有保守的AKT磷酸化序列,在體外能迅速被AKT磷酸化。AKT是通過改變Forkhead蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位來起作用的。AKT激活時(shí),磷酸化Forkhead蛋白使其發(fā)生細(xì)胞核內(nèi)到細(xì)胞核外轉(zhuǎn)位,磷酸化的Forkhead蛋白能抑制促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄功能,Forkhead蛋白的靶基因包括FasL、TRAIL和Bcl-6、Bim、Bax,從而負(fù)調(diào)控凋亡信號(hào),促進(jìn)細(xì)胞存活,甚至發(fā)生惡變。<

10、br>　　 目前,通過基因干預(yù)方法敲除或小分子藥物抑制PI3K-AKT相關(guān)基因,阻斷其下游多種抗凋亡效應(yīng)分子的活化,促進(jìn)細(xì)胞凋亡已成為腫瘤治療研究的熱點(diǎn),本課題組己成功應(yīng)用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建了抑制PI3K p85a表達(dá)的大腸癌LoVo、SW480穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株LoVo(shRNA/324)(L324)、SW480(shRNA/1124)(SW1124),實(shí)驗(yàn)證明抑制PI3K p85a表達(dá)后,磷酸化AKT、FoxO蛋白表達(dá)降低,細(xì)胞核內(nèi)

11、FoxO蛋白含量增高,細(xì)胞生長(zhǎng)活力抑制,細(xì)胞周期停滯于G0/G1期,但單獨(dú)抑制PI3K p85a表達(dá)后,并未發(fā)現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象。有研究資料顯示沉默PI3K p85a表達(dá)后,可增加癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性,遂本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步在RNA于擾抑制PI3K p85a表達(dá)的基礎(chǔ)上,研究轉(zhuǎn)染細(xì)胞L324、SW1124對(duì)化療藥物5-FU的敏感性是否較對(duì)照組LoVo、SW480細(xì)胞顯著增加,并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　 材料與方法
　　

12、一、PI3K p85a在大腸癌癌變過程中的表達(dá)及臨床意義
　　 應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)PI3K p85a蛋白在大腸粘膜正常組織、大腸息肉、大腸腺瘤以及原發(fā)性大腸癌組織中的表達(dá)情況。
　　 二、RNA干擾靶向抑制PI3K p85a表達(dá)后,大腸癌細(xì)胞LoVo、SW480對(duì)5-FU敏感性的變化。
　　 1、MTT法計(jì)算對(duì)照組LoVo、SW480細(xì)胞和轉(zhuǎn)染組L324、SW1124細(xì)胞5-FU的IC50(50

13、％inhibitory concentration)值。
　　 2 Hoechst33258染色觀察5-FU刺激LoVo和L324、SW480和SW1124細(xì)胞48小時(shí)后,倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)改變,200×視野下選擇5個(gè)典型視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞,并計(jì)算每個(gè)視野凋亡核所占比率,記為該組細(xì)胞的凋亡率,并根據(jù)凋亡率的差異反映各組大腸癌細(xì)胞對(duì)5-FU敏感件的差異。
　　 3、JC-1線粒體膜電位檢測(cè)方法檢測(cè)5

14、-FU刺激LoVo和L324、SW480和SW1124細(xì)胞48小時(shí)后,倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞漿內(nèi)線粒體膜電位的變化,200×視野下選擇5個(gè)典型視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞,并計(jì)算每個(gè)視野紅色熒光細(xì)胞所占比率,從而比較各組大腸癌細(xì)胞對(duì)5-FU敏感性的差異。
　　 4、Western blot檢測(cè)5-FU刺激LoVo和1324、SW480和SW1124四種細(xì)胞48小時(shí)后,凋亡蛋白Bax、Bcl-6、Bim表達(dá)的差異。
　　

15、 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 所有結(jié)果均經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論
　　 1、PI3K p85a蛋白的表達(dá)在大腸正常粘膜、大腸息肉、大腸腺瘤、大腸癌組織中呈上升趨勢(shì),說明PI3K p85a在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,值得注意的是PI3K p85a在

16、大腸癌癌前病變-腺瘤中表達(dá)亦顯著增加,提示PI3K p85a可能成為大腸癌早期診斷的標(biāo)志物以及大腸癌靶向治療的新靶點(diǎn)。
　　 2、轉(zhuǎn)染組L324、SW1124細(xì)胞5-FU的IC50值較對(duì)照組LoV0、SW480細(xì)胞5-FU的IC50值顯著降低,說明抑制PI3K p85a表達(dá)后,可明顯增加大腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物5-FU的敏感性,降低5-FU的治療濃度,亦很大程度的減輕5-FU的毒副作用。為臨床解決大腸癌細(xì)胞對(duì)5-FU耐藥的問題,提供

17、理論依據(jù),使基因治療和化療聯(lián)合治療大腸癌成為可能。
　　 3、抑制PI3K p85a表達(dá)后,Hoechst33258染色和JC-1線粒體膜電位檢測(cè)均從形態(tài)學(xué)上顯示轉(zhuǎn)染組L324、SW1124細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感件較對(duì)照組LoVo、SW480細(xì)胞顯著增加,支持了MTT結(jié)果。
　　 4、RNA干擾靶向抑制PI3K p85a表達(dá),5-FU刺激48小時(shí)后,轉(zhuǎn)染組L324、SW1124細(xì)胞中凋亡蛋白Bax、Bcl-6、Bim的表達(dá)