誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腦出血的實驗研究.pdf

1、腦卒中具有高發(fā)病率、高死亡率、高復(fù)發(fā)率和高致殘率“四高”特點，是嚴(yán)重威脅人類健康的重大常見疾病。其中，腦出血(ICH)的致死率和致殘率比腦缺血高，經(jīng)常遺留更為嚴(yán)重的持續(xù)性神經(jīng)功能障礙。
　　現(xiàn)有針對ICH的臨床治療手段，包括藥物治療和外科手術(shù)治療，主要目的是支持治療和防治并發(fā)癥，缺乏直接針對ICH病理生理所致?lián)p傷的有效特異性治療手段，治療效果有限。
　　由于神經(jīng)元的不可再生性、內(nèi)源性NSCs數(shù)量稀少等原因，神經(jīng)系統(tǒng)在ICH損

2、傷后自身修復(fù)的能力十分有限。因此，采用干細(xì)胞移植治療以恢復(fù)或重建ICH受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，已成為近年來倍受研究者們關(guān)注的具有極大應(yīng)用潛力的治療方案之一。
　　新現(xiàn)的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)技術(shù)給ICH治療帶來了新的希望。ICH患者特異的、個體化的iPSCs及其來源的NSCs移植能夠避免異體細(xì)胞移植面臨的免疫排斥和倫理等難題，在治療難治性ICH方面具有較大應(yīng)用潛力。
　　本實驗研究的目的是首先將重癥ICH患者皮

3、膚成纖維細(xì)胞體外重編程為iPSCs，接著將iPSCs體外定向誘導(dǎo)分化為NSCs，最后在ICH模型大鼠體內(nèi)評估iPSCs來源的NSCs移植治療的效果和可能機制，為利用ICH患者自體iPSCs及其來源的NSCs進行個體化的移植治療奠定理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。
　　第一部分:誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)及鑒定
　　目的:
　　將重癥ICH患者皮膚成纖維細(xì)胞體外重編程為iPSCs并對其進行體內(nèi)體外的系列鑒定。
　　方法:
　?、俳?jīng)

4、患者及家屬知情同意后，采用鉆取活組織檢查術(shù)采集一名ICH患者4mm2皮膚樣本;②酶消化法分離皮膚成纖維細(xì)胞，并進行培養(yǎng)擴增;③使用分別攜帶人OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc基因的慢病毒感染成纖維細(xì)胞，使之形成iPSCs樣細(xì)胞克隆團;④對iPSCs樣細(xì)胞克隆團進行鑒定:堿性磷酸酶(AP)染色，免疫熒光染色檢測表達(dá)hESCs特異蛋白Oct4、SOX2、SSEA4、TRA-1-60和Nanog，擬胚體(EB)形成實驗體外鑒定其多分化潛

5、能，畸胎瘤形成實驗體內(nèi)鑒定其多分化潛能和體外連續(xù)傳代檢測其自我更新能力。
　　結(jié)果:
　?、買CH患者皮膚成纖維細(xì)胞被誘導(dǎo)為類ESCs克隆;②類ESCs克隆呈現(xiàn)與hESCs相似的表型和特性:克隆形態(tài)相似，AP染色強陽性，持續(xù)表達(dá)Nanog、OCT4、SOX2、SSEA-4和TRA-1-60等hESCs多潛能標(biāo)志;③類ESCs克隆具有與hESCs相似的多能性:體外形成EBs并表達(dá)三胚層細(xì)胞標(biāo)志AFP、a-SMA、Desmin、

6、β-ⅢTubulin和GFAP，在SCID鼠肌肉內(nèi)形成包含三胚層組織的畸胎瘤;④iPSCs具有自我更新能力。
　　結(jié)論:
　　ICH患者皮膚成纖維細(xì)胞被體外重編程為iPSCs。
　　第二部分:體外誘導(dǎo)iPSCs定向分化為NSCs
　　目的:
　　將ICH患者皮膚成纖維細(xì)胞來源的iPSCs體外定向誘導(dǎo)為NSCs。
　　方法:
　　首先將iPSCs體外誘導(dǎo)形成EBs，接著將EBs誘導(dǎo)形成神經(jīng)管樣結(jié)構(gòu)

7、，再形成球狀NSCs細(xì)胞克隆團。對神經(jīng)球NSCs進行形態(tài)、表達(dá)Nestin、自我更新能力和向特定神經(jīng)細(xì)胞定向分化的能力等鑒定。
　　結(jié)果:
　　iPSCs經(jīng)過從EBs和玫瑰花結(jié)樣的神經(jīng)管樣結(jié)構(gòu)階段，最終形成含大量NSCs的球狀細(xì)胞克隆團。經(jīng)鑒定，神經(jīng)球形態(tài)與從腦部分離的NSCs球狀克隆團非常相似，持續(xù)表達(dá)NSCs特異標(biāo)志蛋白Nestin，具有自我更新能力和向神經(jīng)元樣及膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞等神經(jīng)細(xì)胞定向分化的能力。
　　結(jié)論:

8、
　　ICH患者皮膚成纖維細(xì)胞來源的iPSCs體外被定向誘導(dǎo)分化為NSCs。
　　第三部分:iPSCs來源的NSCs移植改善ICH模型大鼠神經(jīng)功能障礙
　　目的:
　　探討iPSCs來源的NSCs移植治療大鼠實驗性ICH的效果及其可能機理。
　　方法:
　　將BrdU預(yù)先標(biāo)記的iPSCs來源的NSCs通過腦立體定向注入ICH模型大鼠腦血腫周圍，隨后通過mNSS和MLPT評分等行為學(xué)評分定期評估ICH模

9、型大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)情況，并通過免疫熒光染色技術(shù)檢測移植的NSCs在ICH大鼠腦內(nèi)的存活、移行和向神經(jīng)細(xì)胞分化等狀況。
　　結(jié)果:
　　與對照組相比，NSCs移植組大鼠mNSS和MLPT評分在ICH后第14天有顯著降低(P＜0.05)，并持續(xù)至ICH后第28天(P＜0.05)，表明NSCs移植組大鼠行為能力得到有效改善。免疫熒光染色結(jié)果顯示，移植的NSCs不僅能夠移行到ICH模型大鼠腦血腫周圍組織內(nèi)存活達(dá)27天，而且能分化為神