瀉火補(bǔ)腎湯對腦出血神經(jīng)干細(xì)胞移植后大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用.pdf

1、研究背景：腦出血后多遺留有不同程度的偏癱、失語等殘疾，致使患者生活質(zhì)量嚴(yán)重下降。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)的發(fā)現(xiàn)給腦血管疾病的治療帶來新的希望，但由于腦出血后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生的數(shù)目有限，不足以修復(fù)腦出血后神經(jīng)損傷，因此采用外源性神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腦出血很有必要。然而腦出血后血腦屏障破壞，大量血液細(xì)胞侵入腦內(nèi)。其中免疫細(xì)胞激活導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放，改變了腦內(nèi)原有的“免疫豁免”環(huán)境。出血后腦內(nèi)存在的大量細(xì)胞因

2、子既可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子的表達(dá)，促進(jìn)抗原遞呈及識別；又可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞MHC分子的表達(dá)，誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)，加重組織損傷。 根據(jù)免疫反應(yīng)理論，腦出血血腦屏障損傷后用NSCs移植治療可能發(fā)生移植物抗宿主反應(yīng)(GVHD)。即以THl為主，TH2、CTL參與的細(xì)胞免疫反應(yīng)。TH1釋放的IFN-γ、INF-α等細(xì)胞因子可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial cell，EC)血管細(xì)胞黏附分子-1(va

3、scular cell adhesion molecule，VCAM-1)的表達(dá)，促進(jìn)白細(xì)胞黏附、變形、游出，侵入腦組織引起炎癥反應(yīng)。因此血管內(nèi)皮細(xì)胞無論在腦出血的炎癥反應(yīng)或免疫排斥過程中，均起著關(guān)鍵作用。 目的：本研究旨在通過觀察瀉火補(bǔ)腎湯對腦出血NSCs移植后大鼠及干擾素-γ(interferon gamma,IFN-γ)干預(yù)后大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(rat cerebral microvascular endothelial

4、 cells，RCMECs)血管細(xì)胞粘附分子-1、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、Fas、FasL表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響，探討瀉火補(bǔ)腎湯在NSCs移植免疫反應(yīng)中對微血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及可能機(jī)制。 方法： 1)體外實驗：用新生7-10天SD乳鼠分離原代鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，培養(yǎng)、傳代后以Ⅷ相關(guān)抗原抗體鑒定。取2-8代細(xì)胞進(jìn)行分組實驗。分空白組、IFN-γ刺激

5、組、正常血清組、瀉火補(bǔ)腎湯血清組共四組進(jìn)行處理。分別用RT-PCR及ELISA檢NVCAM-1、TGF-β1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，TUNEL檢測細(xì)胞凋亡，RT-PCR及免疫細(xì)胞化學(xué)方法觀察Fas、FasL mRNA及蛋白表達(dá)。 2)體內(nèi)實驗：90只SD大鼠隨機(jī)分為正常組(n=10)、假手術(shù)組(n=20)、腦出血組(n=20)、NSCs移植組(n=20)及瀉火補(bǔ)腎湯組(n=20)，用Ⅶ型膠原酶注入蒼白球復(fù)制腦出血模型，術(shù)后2

6、d進(jìn)行NSCs移植，移植后第4d、7d分兩批處死動物。分別采用RT-PCR及ELISA檢測VCAM-1、TGF-βl mRNA和蛋白表達(dá)水平，TUNEL檢測細(xì)胞凋亡，RT-PCR及免疫組織化學(xué)方法觀察Fas、FasL mRNA及蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： 體外實驗： 1.RT-PCR及ELISA檢測顯示：IFN-γ刺激后可見RCMECs形態(tài)改變，細(xì)胞活力下降，VCAM-1、TGF-β1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均升高(P

7、<0.01)。瀉火補(bǔ)腎湯血清處理后細(xì)胞形態(tài)及活力改善，VCAM-1及TGF-β1表達(dá)降低，與正常血清組、IFN-γ刺激組比較差異顯著(P<0.05)。 2.TUNEL檢測顯示：IFN-γ刺激后RCMECs大量凋亡，瀉火補(bǔ)腎湯處理后TUNEL陽性細(xì)胞明顯減少，與正常血清組、IFN-γ刺激組比較差異有顯著性(P<0.01)。 3.免疫組化及RT-PCR檢測顯示：IFN-γ刺激后，RCMECs Fas、FasL蛋白及mRNA表

8、達(dá)均增加(P<0.01)。瀉火補(bǔ)腎湯組處理后Fas表達(dá)降低(P<0.05)，F(xiàn)asL表達(dá)明顯增加，與正常血清組、IFN-γ刺激組比較差異顯著(P<0.01)。 體內(nèi)實驗： 1.RT-PCR顯示正常組及假手術(shù)組大鼠腦內(nèi)見微量VCAM-1mRNA表達(dá)，腦出血組大鼠VCAM-1 mRNA表達(dá)較正常組、假手術(shù)組增多(P<0.05)，NSCs移植后VCAM-1 mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)，瀉火補(bǔ)腎湯組表達(dá)明顯低于NSCs

9、移植組(P<0.01)，除正常組外各組7d VCAM-1 mRNA表達(dá)較4d均有下降(P<0.05)。血清VCAM-1表達(dá)與腦內(nèi)VCAM-1 mRNA表達(dá)趨勢一致。 TGF-βlmRNA在正常大鼠腦內(nèi)有微量表達(dá)，NSCs移植組較腦出血組表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)，瀉火補(bǔ)腎湯組表達(dá)更強(qiáng)，與其它各組比較有顯著性差異(P<0.01)；除正常組和假手術(shù)組外，各組7d TGF-βlmRNA表達(dá)較4d均有下降(P<0.05)。ELISA檢測顯示各組血

10、清TGF-β1水平較正常組下降，以NSCs移植組最低。7d與4d比較，除正常組外各組TGF-β1均有回升，以瀉火補(bǔ)腎湯組最明顯。 2.TUNEL檢測顯示：正常鼠腦中未見凋亡細(xì)胞，腦出血后出血區(qū)周圍可見凋亡細(xì)胞。NSCs移植后凋亡細(xì)胞增多(P<0.05)；瀉火補(bǔ)腎湯干預(yù)后TUNEL陽性細(xì)胞明顯減少(P<0.05)；除正常組外，各組7d時TUNEL陽性細(xì)胞較4d減少。 3.免疫組化定性檢測示腦出血組及NSCs移植組腦內(nèi)均有F

11、as、FasL蛋白的表達(dá)。RT-PCR半定量檢測示正常組大鼠腦內(nèi)有少量FasmRNA表達(dá)，假手術(shù)組、腦出血組、NSCs移植組Fas mRNA表達(dá)增加，以NSCs移植組最強(qiáng)(P<0.05)，瀉火補(bǔ)腎湯組明顯低于NSCs移植組(P<0.05)。除正常組外7d時各組Fas tuRNA表達(dá)較4d下降。正常組及假手術(shù)組大鼠腦內(nèi)僅見微量FasL tuRNA表達(dá)，腦出血組、NSCs移植組、瀉火補(bǔ)腎湯組FasL mRNA表達(dá)增強(qiáng)，以瀉火補(bǔ)腎湯組最強(qiáng)(P

12、<0.05)。且同組內(nèi)前后比較表達(dá)下降(P<0.05)。 結(jié)論: 1.WN-γ體外干預(yù)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，建立的的免疫損傷反應(yīng)模型中存在細(xì)胞活力下降，VCAM-1、TGF-β1和Fas、FasL表達(dá)上調(diào)； 2.腦出血大鼠移植NSCs后出現(xiàn)VCAM-1、TGF-βl和Fas、FasL表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞凋亡增加；提示腦內(nèi)存在炎癥和免疫反應(yīng)增強(qiáng)， 3.瀉火補(bǔ)腎湯能抑制腦出血NSCs移植后的炎癥和免疫反應(yīng)，保護(hù)腦微