檢測大腸桿菌菌毛的新型凝集技術(shù)研究.pdf

1、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(ETEC)作為最主要的腸道病原菌，常引起犢牛、羔羊、仔豬等幼畜腹瀉，在世界大部分地區(qū)廣泛流行，具有高發(fā)病率和死亡率，給畜牧業(yè)帶來嚴(yán)重的損失，因此建立一種快速、簡便、靈敏、特異的診斷技術(shù)對防治該病具有重要意義。ETEC可在菌毛黏附素協(xié)助下定植在腸道內(nèi)，繼而產(chǎn)生腸毒素，引起幼畜腹瀉。許多ETEC菌株帶有菌毛黏附素，如K88、K99、987p和F41，因此，通過快速檢測菌毛黏附素，可為ETEC的檢測提供重要的參考依據(jù)。

2、r>　　本研究旨在通過提取ETEC菌毛K88ab、K99、987p和F41，免疫新西蘭白兔制備單因子血清;以彩色二氧化硅微球(CSN)為載體，將單因子血清修飾到微球表面，制備免疫彩色二氧化硅微球(ICSN)，建立一種新型間接凝集技術(shù)用于K88ab、K99、987p和F41菌毛的快速檢測。
　　單因子血清的制備。分別提取四種菌毛，免疫新西蘭白兔，每隔21d免疫一次，共免疫3次;無菌采集兔心血制備抗血清，玻片凝集試驗(yàn)結(jié)果顯示，抗K88

3、ab、K99、987p和F41血清凝集價(jià)分別為1∶256、1∶512、1∶128和1∶4096。交叉凝集試驗(yàn)結(jié)果顯示，K88ab抗血清與K99抗原凝集價(jià)為1∶32， K99、987p和F41抗血清均與K88抗原交叉凝集，凝集價(jià)分別為1∶8、1∶16和1∶16。通過反應(yīng)條件優(yōu)化，最終確定將抗血清和與之有交叉凝集的菌體壓積1∶1混合，4℃48h吸收交叉抗體。結(jié)果顯示，吸收后的抗K88ab、K99、987p和F41血清只與自身抗原發(fā)生凝集反應(yīng)

4、，特異性良好，凝集價(jià)分別為1∶64、1∶256、1∶32和1∶2048。
　　ICSN的制備及應(yīng)用。用反相微乳液法制備的CSN與單因子血清結(jié)合制備了不同顏色的K88ab、K99、987p和F41 ICSN，同時(shí)使用三種不同顏色的ICSN檢測抗原，結(jié)果顯示顏色對凝集效果沒有影響。通過反應(yīng)條件優(yōu)化，最終確定玻片凝集試驗(yàn)的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為:ICSN20μL、菌液20μL(菌液濃度范圍為106～109CFU·mL-1)，25℃～37℃

5、反應(yīng)1 min。特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，K88ab、K99、987p和F41 ICSN與ETEC C83903(K88ab+)、C82529(K99+)、C83915(987p+)、O142(F41+)、大腸桿菌DN69-A、大腸桿菌DN89-B、綠膿桿菌(SD004)、豬丹毒桿菌(CVCC124)、豬霍亂沙門氏菌(CVCC503)、巴氏桿菌(CVCC430)、生理鹽水不發(fā)生交叉凝集反應(yīng)。敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，K88ab、K99、987p和F

6、41 ICSN對菌液的最小檢出濃度為1.0～5.1×106CFU·mL-1。制備的ICSN在4℃保存30 d，其特異性、敏感性沒有明顯變化，具有良好的穩(wěn)定性。對雙盲樣品的檢測結(jié)果同實(shí)際樣品的檢測結(jié)果，100％符合。新型凝集試驗(yàn)結(jié)果直觀、易于判斷，且每次使用的抗體量為玻片凝集試驗(yàn)的1/500，適用于抗體量少而檢測樣品多的情況。
　　本研究建立了一種以CSN為載體，用于檢測ETEC K88ab、K99、987p、F41菌毛的新型間接凝