醫(yī)藥廢水中大腸桿菌免疫快速檢測方法研究.pdf

1、世界各國的專家和學(xué)者都在努力尋找一種快速檢測大腸桿菌的新方法，目前已經(jīng)發(fā)展了分子生物學(xué)檢測方法、酶底物法及免疫學(xué)方法等。
　　本文從醫(yī)藥廢水中篩選出大腸桿菌，制備免疫原，采用多克隆抗體制備技術(shù)制備了抗大腸桿菌抗體，并建立了間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法，并在此基礎(chǔ)上研制了間接ELISA試劑盒，具體成果如下：
　　1.從醫(yī)藥廢水中篩選大腸桿菌，制備大腸桿菌全菌體免疫原，然后，使用該免疫原對新西蘭大白兔免疫，獲得兔抗大腸桿菌免疫血清，經(jīng)

2、過辛酸-硫酸銨兩步法純化后獲得抗血清，其效價為12800，經(jīng)過計算純化后抗體的蛋白質(zhì)的含量為2.50mg/mL。
　　2.建立了大腸桿菌的間接ELISA快速檢測方法，優(yōu)化確定了具體實驗參數(shù)：包被抗原的最佳使用稀釋度為200倍，酶標(biāo)二抗和一抗的最佳稀釋度分別為2000倍和12800倍；0.5％BSA為最佳封閉液，封閉2h作為最佳封閉時間；選擇37℃溫育60min，含4%PEG稀釋液作為最佳的抗原與一抗的反應(yīng)條件；選擇37℃溫育60m

3、in，含4%PEG稀釋液作為最佳的一抗與二抗的溫育條件。
　　3.進行了大腸桿菌的梯度實驗，濃度在1012cfu/mL－10cfu/mL之間，用所建立的間接競爭ELISA法測定，結(jié)果表明在103cfu/mL－109 cfu/mL有良好的線性關(guān)系，表明ELISA的檢測限為103cfu/mL。將預(yù)處理后的醫(yī)藥廢水梯度稀釋，用所建立的間接競爭ELISA法測定，同時與國標(biāo)法（MPN法）和活菌計數(shù)法做比較，結(jié)果表明間接ELISA測得結(jié)果與M

4、PN所測結(jié)果一致，但是由于間接ELISA對死菌能檢出，所以檢測值較MPN法大。
　　4.制備了間接ELISA試劑盒，對所組建試劑盒進行了包被時間的優(yōu)化，試驗結(jié)果表明該試劑盒在37℃下包被1h，與在4℃下包被過夜所測的OD值相近，所以本試劑盒選擇在37℃下包被1h作為包被時間；對自制的試劑盒進行了方法學(xué)評價，包括：特異性、重復(fù)性及靈敏度。對分別含有大腸桿菌（所篩選）、E.coli、酵母菌、雷氏普羅威登斯菌（ProvidenciaRe