水體中大腸桿菌快速檢測(cè)方法和儀器的研究.pdf

1、大腸桿菌是人和動(dòng)物腸道中的常居菌,常隨人及動(dòng)物糞便一塊排出,廣泛傳播于自然環(huán)境中,對(duì)水源造成污染。在衛(wèi)生質(zhì)量的評(píng)價(jià)和控制中,通常采用大腸桿菌作為指示菌來了解水體的受污染狀況,從而評(píng)價(jià)其質(zhì)量以保證衛(wèi)生安全。因此,建立水體中大腸桿菌的快速檢測(cè)方法,成為環(huán)境保護(hù)、飲水衛(wèi)生、食品衛(wèi)生和流行病學(xué)領(lǐng)域中最重要的研究對(duì)象之一。
　　大腸桿菌的傳統(tǒng)檢測(cè)方法,如濾膜法,多管發(fā)酵法等,雖然結(jié)果比較準(zhǔn)確,但是都存在著檢測(cè)周期長(zhǎng)、程序復(fù)雜、所需試劑繁多等

2、缺點(diǎn)。目前,國內(nèi)外研究人員已經(jīng)發(fā)展一些新方法對(duì)大腸桿菌進(jìn)行快速檢測(cè),主要包括酶底物法、聚合酶鏈法、免疫分析法、電化學(xué)方法、熒光法等。這些方法雖然縮短了檢測(cè)時(shí)間,簡(jiǎn)化了檢測(cè)流程,但是普遍降低了檢測(cè)的靈敏度和選擇性。因此亟需一種既快速,又能保持高靈敏度,高選擇性的大腸桿菌檢測(cè)方法。
　　近年來,隨著納米科技的發(fā)展,納米材料所特有的許多優(yōu)異特性使其在分析化學(xué)中得到了越來越多的應(yīng)用。本論文運(yùn)用碳納米管和磁性納米顆粒等納米材料制備了Tyr/

3、MWNTs-Chit/GCE生物傳感器和Tyr/Fe3O4 MNPs-CNTs/GCE生物傳感器以快速檢測(cè)大腸菌群,檢測(cè)時(shí)間可控制在5 h之內(nèi),檢測(cè)限低至10 cfu/mL。根據(jù)磁性納米顆粒良好的生物兼容性的特點(diǎn),又將生物功能化的磁性納米顆粒（BMNPs）和三磷酸腺苷（ATP）生物發(fā)光法相結(jié)合發(fā)展了了一種靈敏、特異性的大腸桿菌快速檢測(cè)方法,并應(yīng)用于檢測(cè)無菌牛奶中培養(yǎng)的大腸桿菌,可獲得較低的檢測(cè)限（20 cfu/mL）和較短的檢測(cè)時(shí)間（約

4、1 h）。
　　論文主要包括以下幾個(gè)部分:
　　第一章緒論簡(jiǎn)要介紹了大腸桿菌的生物特性、致病性以及衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。總結(jié)了檢測(cè)大腸桿菌的傳統(tǒng)方法以及酶底物法、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、免疫檢測(cè)技術(shù)和化學(xué)發(fā)光法等新方法。然后回顧了納米材料的特性、制備和表征方法,并就納米材料在快速檢測(cè)大腸桿菌中的應(yīng)用展開了討論。
　　第二章Tyr/MWNTs-Chit/GCE生物傳感器的制備及其在快速檢測(cè)大腸菌群中的應(yīng)用基于多壁碳納米管（MWNTs）-殼

5、聚糖（Chit）復(fù)合物,制備了一種靈敏、穩(wěn)定的酪氨酸酶（Tyr）生物傳感器。由于MWNTs-Chit復(fù)合物良好的生物兼容性和電催化能力,Tyr/MWNTs-Chit/GCE生物傳感器在苯酚的檢測(cè)中具有高靈敏度（412 mA/M）,低檢測(cè)限（5.0 nM）,較寬的線性范圍(1.0×10-8-2.8×10-5M)以及良好的穩(wěn)定性（10天后仍保持93％的活性）。把Tyr/MWNTs-Chit/GCE生物傳感器進(jìn)一步應(yīng)用于大腸菌群的檢測(cè),大腸菌

6、群在104-107cfu/mL范圍內(nèi)與電流響應(yīng)成正比;經(jīng)過5 h的培養(yǎng),進(jìn)一步降低大腸菌群的檢測(cè)限至10 cfu/mL。
　　第三章Tyr/Fe3O4 MNPs-CNTs/GCE生物傳感器在流動(dòng)注射法快速檢測(cè)大腸菌群中的應(yīng)用該文基于Fe3O4磁性納米顆粒（MNPs）-碳納米管（CNTs）復(fù)合物修飾電極制備了一種靈敏,穩(wěn)定的酪氨酸酶（Tyr）生物傳感器,并進(jìn)一步應(yīng)用于流動(dòng)注射法（FIA）檢測(cè)大腸菌群。CNTs表面包裹了帶正電荷的聚二

7、甲基二丙烯氯化銨（PDDA）,從而可以吸附帶負(fù)電荷的Fe3O4 MNPs。制得的Fe3O4 MNPs-CNTs納米復(fù)合物被修飾在光玻碳電極上,而Tyr則通過戊二醛交聯(lián)在此修飾電極上。這種基底為保持Tyr的生物活性提供了良好的微環(huán)境,其中的CNTs還可以改善對(duì)苯酚的電化學(xué)檢測(cè)。這種Tyr生物傳感器在苯酚的檢測(cè)中顯示了較寬的線性范圍(1.0×10-8-3.9×10-5M),較低的檢測(cè)限(5.0×10-9M)和較高的靈敏度（516 mA/M）

8、。而且,這種生物傳感器與FIA系統(tǒng)聯(lián)用可以用來檢測(cè)以大腸桿菌（E.coli）為代表的大腸菌群。其原理是檢測(cè)大腸菌群溶液中酶反應(yīng)產(chǎn)物苯酚的濃度。在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下,FIA系統(tǒng)檢測(cè)到的電流響應(yīng)與細(xì)菌濃度呈在20到1×105cfu/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,其檢測(cè)限低至10 cfu/mL,并且總檢測(cè)時(shí)間可控制在4h之內(nèi)。這種生物傳感器-FIA檢測(cè)系統(tǒng)可以應(yīng)用于快速的自動(dòng)臨床診斷和水質(zhì)分析。
　　第四章結(jié)合生物功能化的磁性納米顆粒和ATP生物

9、發(fā)光法快速檢測(cè)大腸桿菌該文將生物功能化的磁性納米顆粒（BMNPs）和三磷酸腺苷（ATP）生物發(fā)光法相結(jié)合發(fā)展了了一種快速、靈敏、特異性的大腸桿菌快速檢測(cè)方法。BMNPs是通過固定一種特異性大腸桿菌抗體在胺基功能化的磁性納米顆粒表面（直徑約20 nm）來制備的,用來捕獲樣品中的大腸桿菌。從透射電子顯微鏡（TEM）圖像上可以看出BMNPs會(huì)吸附在整個(gè)大腸桿菌的表面,從而使大腸桿菌具有磁性,可以通過施加外部磁場(chǎng)很容易地從樣品中分離出來。利用B

10、MNPs分離出來的大腸桿菌的濃度可以通過ATP生物發(fā)光法測(cè)定。通過優(yōu)化ATP生物發(fā)光法的檢測(cè)條件提高了整個(gè)方法的靈敏度。此檢測(cè)方法應(yīng)用于檢測(cè)無菌牛奶中培養(yǎng)的大腸桿菌可獲得較低的檢測(cè)限（20 cfu/mL）和較短的檢測(cè)時(shí)間（約1 h）。
　　第五章細(xì)菌快速分析儀的研制本章基于細(xì)菌的生物學(xué)特性以及電化學(xué)工作原理開發(fā)研制了細(xì)菌快速分析儀,儀器對(duì)細(xì)菌的檢測(cè)具有快速、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn),不但可檢測(cè)水體中細(xì)菌總量,而且還可檢測(cè)水體中的大腸桿菌的