化膿隱秘桿菌溶血素單克隆抗體在解析其結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用.pdf

1、化膿隱秘桿菌(Trueperella pyogenes，T.pyogenes)是一種常在菌，通常寄生于動(dòng)物的皮膚粘膜、口咽、上呼吸道泌尿生殖和胃腸道。T.pyogenes同時(shí)也是一種人和動(dòng)物（特別是牛、羊和豬等重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物）的條件致病菌。T.pyogenes感染給養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失較大，染病牲畜通常表現(xiàn)化膿性感染。溶血素(Pyolysin，PLO)是化膿隱秘桿菌分泌的一種外毒素，并且是其唯一的溶血素，屬于膽固醇依賴性溶細(xì)胞素家族(CD

2、Cs)。用重組PLO通過(guò)肌肉注射途徑接種小鼠可引起注射部位局部化膿，說(shuō)明PLO是化膿隱秘桿菌引起化膿性感染過(guò)程中的主要毒力因子。
　　本研究首先制備了兩株針對(duì)PLO的單克隆抗體，其中AP-4F12可以顯著抑制PLO溶血活性，而AP-1A3并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)具有抑制溶血的活性。采用western-blot方法對(duì)這兩株單抗所針對(duì)的抗原關(guān)鍵區(qū)域分析結(jié)果表明，AP-1A3所針對(duì)的抗原關(guān)鍵區(qū)域是PLO的第64位到79位氨基酸（包括信號(hào)肽在內(nèi)為第91

3、位至106位氨基酸），即VPVTKDQLKDGTYTVF，而AP-4F12所針對(duì)的抗原關(guān)鍵區(qū)域是PLO的第58位到75位氨基酸（包括信號(hào)肽在內(nèi)為第85位到102位氨基酸），即GESIENVPVTKDQLKDGT。結(jié)果表明PLO第58至63位氨基酸可能對(duì)PLO分子發(fā)揮溶血活性非常重要。隨后，本研究利用定點(diǎn)突變法制備了六個(gè)PLO突變體，將第58至63位氨基酸分別用丙氨酸替代并檢測(cè)每一個(gè)突變體蛋白的溶血活性。結(jié)果表明， PLO的第58-62位

4、氨基酸（包括信號(hào)肽在內(nèi)為85到89位氨基酸），即58位甘氨酸(G58)、59位谷氨酸(E59)、60位絲氨酸(S60)、61位異亮氨酸(I61)以及62位谷氨酸(E62)的突變能夠影響PLO的溶血活性，其中第61位異亮氨酸對(duì)維持PLO的溶血活性是非常重要的。
　　綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)制備的兩株單克隆抗體所針對(duì)的抗原關(guān)鍵區(qū)域中的氨基酸殘基在PLO發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)過(guò)程中的作用進(jìn)行了探討，為闡明PLO分子結(jié)構(gòu)與其成孔活性之間的關(guān)系提供部