應(yīng)用上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析技術(shù)快速定量檢測(cè)食品中黃曲霉毒素(M1、B1)的方法建立.pdf

1、目的：
　　以上轉(zhuǎn)發(fā)光（Up-Converting Phospher，UCP）材料作為標(biāo)記物，與經(jīng)典免疫層析方法結(jié)合，建立可對(duì)奶制品中黃曲霉毒素M1及糧食中黃曲霉毒素B1直接進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析(up-converting phosphor technology-based lateral-flow，UPT-LF)快速定量檢測(cè)方法。
　　方法：
　　1.上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析試紙制備：分別以黃曲霉毒素M1（AFM1

2、）單克隆抗體，黃曲霉毒素M1（AFM1）與小牛血清白蛋白（BSA）偶聯(lián)物：AFM1-BSA；黃曲霉毒素B1（AFB1）單克隆抗體，黃曲霉毒素B1（AFB1）與小牛血清白蛋白（BSA）偶聯(lián)物：AFB1-BSA作為特異性生物探針，以UCP顆粒作為標(biāo)記物，采用競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)作為檢測(cè)模型，分別建立免疫層析試紙：黃曲霉毒素M1上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析檢測(cè)試紙(UPT-LF-AFM1)及黃曲霉毒素B1上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析檢測(cè)試紙(UPT-LF-AFB1)。

3、>　　2.上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析檢測(cè)試紙性能評(píng)價(jià)：
　　1）UPT-LF-AFM1：配置系列濃度AFM1毒素標(biāo)準(zhǔn)品，評(píng)價(jià)UPT-LF-AFM1包括檢測(cè)敏感性、線性、精密性在內(nèi)的檢測(cè)性能。對(duì)實(shí)際牛奶及奶粉樣品同時(shí)進(jìn)行UPT-LF-AFM1及LC-MS檢測(cè)，評(píng)價(jià)UPT-LF-AFM1對(duì)實(shí)際樣品的定性及定量檢測(cè)能力。
　　2）UPT-LF-AFB1：配置系列濃度AFB1毒素標(biāo)準(zhǔn)品，評(píng)價(jià)UPT-LF-AFB1包括檢測(cè)敏感性、線性、精密性在

4、內(nèi)的檢測(cè)性能，同時(shí)以其余相關(guān)生物毒素標(biāo)準(zhǔn)品評(píng)價(jià)UPT-LF-AFB1檢測(cè)特異性。將AFB1毒素標(biāo)準(zhǔn)品添加到實(shí)際糧食樣品中作為檢測(cè)樣品，評(píng)價(jià)UPT-LF-AFB1對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)能力及其耐受性。
　　結(jié)果：
　　1.上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析試紙制備：
　　1）UPT-LF-AFM1：將抗AFM1單克隆抗體、羊IgG分別與UCP顆粒共價(jià)偶聯(lián)，用結(jié)合物稀釋液將兩種結(jié)合物等比混合，以終濃度1.5mg?mL-1浸泡玻璃纖維作為結(jié)合墊。A

5、FM1-BSA與兔抗羊IgG分別配制為0.5 mg?mL-1、0.3 mg?mL-1，以2μL?cm-1噴點(diǎn)于分析膜上作為檢測(cè)帶（T）與質(zhì)控帶（C）。
　　2）UPT-LF-AFB1：將抗AFB1單克隆抗體、兔抗羊IgG分別與UCP顆粒共價(jià)偶聯(lián)，用結(jié)合物稀釋液將兩種結(jié)合物等比混合，以終濃度1mg?mL-1浸泡玻璃纖維作為結(jié)合墊。AFB1-BSA與羊IgG均配制為0.5 mg?mL-1，以2μL?cm-1噴點(diǎn)于分析膜上作為檢測(cè)帶（T

6、）與質(zhì)控帶（C）。
　　2.上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析檢測(cè)試紙性能評(píng)價(jià)：
　　1）UPT-LF-AFM1：對(duì)奶粉中AFM1檢測(cè)敏感性可達(dá)0.1ppb（μg?Kg-1）、在0.1~0.7ppb（μg?Kg-1）間具有較好線性（ r=-0.99359,P=0.00641）；牛奶中AFM1檢測(cè)敏感性可達(dá)0.3ppb（μg?L-1），在0.3~0.7ppb（μg?L-1）間具有較好線性（r=-0.99938，P<0.05），每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)量的

7、變異系數(shù)小于15％。在定性檢測(cè)評(píng)價(jià)中，對(duì)奶粉檢測(cè)靈敏度Se=100%，特異度Sp=85%，ROC曲線下面積為0.978±0.036；牛奶檢測(cè)中靈敏度Se=81%，特異度Sp=88%， ROC曲線下面積為0.891±0.099；與LC-MS結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，無(wú)顯著差異（P>0.05）。在定量檢測(cè)評(píng)價(jià)中，UPT-LF-AFM1對(duì)于奶粉及牛奶中AFM1檢測(cè)均具有較好回收率，與LC-MS比較無(wú)明顯差異（奶粉：t=0.66，P>0.05；牛奶：t

8、=1.01， P>0.05）。
　　2）UPT-LF-AFB1：對(duì)AFB1檢測(cè)敏感性可達(dá)0.03ng?mL-1，在0.03-1000ng?mL-1間具有較好線性（r=-0.98459，P<0.0001），每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)變異系數(shù)小于10%。特異性較優(yōu)，除與結(jié)構(gòu)相似的AFM1存在一定程度的交叉反應(yīng)外，與赭曲霉毒素、蓖麻毒素、肉毒毒素等七種毒素均無(wú)交叉反應(yīng)。UPT-LF-AFB1對(duì)包括花生、大紅豆、玉米等在內(nèi)的15種糧食樣本耐受性均較