泰國伯克霍爾德氏菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)基于鋅離子轉(zhuǎn)運的抗氧脅迫功能研究.pdf

1、鋅參與許多細菌蛋白結(jié)構(gòu)形成和催化過程，其對生命體的生長和發(fā)育必不可少。在病原菌感染脊椎動物的過程中，病原菌時常面臨鋅不足問題。為了獲得足夠的鋅用以生存和感染，細菌已進化出了一系列有效鋅轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。本研究中，我們以泰國伯克霍爾德氏菌（Burkholderia thailandensis）為實驗對象，研究泰國伯克霍爾德氏菌中的第四套六型分泌系統(tǒng)(T6SS-4)在鋅離子輸入過程中的作用，并對T6SS-4參與的鋅離子輸入過程進行闡釋。具體研究結(jié)果

2、如下:
　　1.分析T6SS-4啟動子區(qū)域的鋅離子應(yīng)答調(diào)控蛋白Zur結(jié)合位點的基礎(chǔ)上，通過凝膠阻滯遷移實驗(EMSA)證明Zur可以直接與T6SS-4基因簇啟動子Zur-Box結(jié)合。qRT-PCR檢測野生型菌株、zur缺失突變株中T6SS-4基因(icmF4，clpV4，hcp4)和tseZ基因的表達水平，結(jié)果表明Zur抑制T6SS-4基因簇的表達。但CHP氧化脅迫能解除Zur對T6SS-4基因和tseZ基因的抑制作用。
　

3、　2.通過構(gòu)建T6SS-4核心基因（clpV4、hcp4、icmF4）和tseZ基因突變株，比較野生型與突變株在氧脅迫下的存活率差異，發(fā)現(xiàn)T6SS-4各突變體和tseZ基因突變株在氧化脅迫下存活率較野生型顯著降低。并且通過HPF探針檢測不同菌株在氧化脅迫條件下胞內(nèi)羥基自由基含量，發(fā)現(xiàn)T6SS-4突變菌株和tseZ基因突變株在氧化脅迫下胞內(nèi)羥基自由基含量均明顯高于野生菌株。證明T6SS-4基因和tseZ基因在抗氧化脅迫過程中起重要作用。<

4、br>　　3.外源Zn2+能提高野生型細菌在氧化脅迫條件下的存活率，而缺失clpV4后外源Zn2+對細菌氧化脅迫條件下存活率的影響被削弱。同時使用ICP-MS測定了在H2O2、CHP脅迫下的胞內(nèi)鋅離子含量，發(fā)現(xiàn)缺失clpV4基因使胞內(nèi)的Zn2+含量顯著降低。在互補clpV4基因后，胞內(nèi)Zn2+含量也回升到了與野生型相近的水平。證明氧化脅迫條件下，T6SS-4參于了Zn2+輸入。
　　4.蛋白分泌檢測發(fā)現(xiàn)TseZ蛋白的分泌依賴于T6

5、SS-4。TseZ蛋白可與Zn2+特異性結(jié)合，并且在氧化脅迫條件下參與Zn2+輸入。外源添加的TseZ蛋白能夠提高野生型細菌和clpV4缺失突變株在氧化脅迫條件下的存活率，說明T6SS-4主要負責(zé)TseZ的分泌，一旦TseZ分泌出去后，其介導(dǎo)的鋅離子從胞外到胞內(nèi)的運輸就不依賴于T6SS-4。
　　綜上所述:本研究發(fā)現(xiàn)泰國伯克霍爾德氏菌在氧化脅迫條件下，解除了Zur對T6SS-4的抑制，高表達T6SS-4將TseZ蛋白分泌至胞外，通