甲醛炎性痛時(shí)脊髓后角HO-1蛋白表達(dá)增加對(duì)神經(jīng)元凋亡的影響.pdf

1、目的：內(nèi)源性一氧化碳（Carbon monoxide，CO）是繼一氧化氮（Nitric oxide，NO）后被發(fā)現(xiàn)的又一重要?dú)怏w信號(hào)分子和神經(jīng)遞質(zhì)，在人和哺乳動(dòng)物的生理及病理過程中具有重要的生物學(xué)功能。血紅素氧合酶（Heme oxygenase，HO）是血紅素代謝的限速酶，廣泛分布于人體各組織器官，其催化血紅素（Heme）降解為CO、鐵及膽綠素（很快被還原成膽紅素）。HO-1為HO的一種亞型，正常時(shí)在神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)較低，但可被多種因素所誘

2、導(dǎo)。
　　 本室以往研究發(fā)現(xiàn)，甲醛炎性痛可誘導(dǎo)脊髓后角NO產(chǎn)生增多，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，NO增加是甲醛炎性痛誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元凋亡的重要機(jī)制之一。已有一些研究發(fā)現(xiàn)，HO/CO系統(tǒng)參與了脊髓傷害性信息的傳遞過程，結(jié)扎坐骨神經(jīng)引起的神經(jīng)損傷可誘導(dǎo)脊髓水平HO蛋白表達(dá)增多，CO產(chǎn)生增多，但甲醛炎性痛引起的傷害性信息傳入是否會(huì)誘導(dǎo)脊髓HO-1表達(dá)發(fā)生改變以及HO-1表達(dá)改變?cè)诩兹┭仔酝凑T導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡過程中發(fā)揮何作用尚未見相關(guān)報(bào)道。
　

3、　 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Western blotting方法首先觀察了甲醛炎性痛大鼠脊髓后角HO-1蛋白表達(dá)的變化，而后采用鞘內(nèi)注射HO-1抑制劑鋅原卟啉Ⅸ（Zinc ProtoporphyrinⅨ，ZnppⅨ），觀察HO-1對(duì)炎性痛大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡的影響，闡明HO-1表達(dá)改變的意義。
　　 1.甲醛炎性痛誘導(dǎo)脊髓HO-1蛋白表達(dá)改變
　　 25只健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體重260～280g，隨機(jī)分為5組，分

4、別為正常對(duì)照組（Control組）、甲醛6h組（F6h）、甲醛12h組（F12h）、甲醛24h組（F24h）、甲醛72h組（F72h），每組5只動(dòng)物。Control組不做任何處理，直接斷頭取材。甲醛各時(shí)間點(diǎn)組動(dòng)物均于足底注射甲醛后觀察自發(fā)疼痛反應(yīng)，然后于不同時(shí)間點(diǎn)斷頭取腰5（L5）脊髓后角，用Western blot方法分別檢測(cè)左、右兩側(cè)脊髓后角HO-1蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：大鼠右后足底注射甲醛后，即刻出現(xiàn)舔、搖、和抬高

5、注射足等自發(fā)痛行為，這些自發(fā)性痛反應(yīng)呈雙時(shí)相性，持續(xù)1 h以上，且注射部位出現(xiàn)紅、腫等明顯的炎癥反應(yīng)。
　　 Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Control組大鼠脊髓后角左、右兩側(cè)的HO-1蛋白條帶面積較小，染色較淺，表明正常大鼠HO-1蛋白有一定量的基礎(chǔ)表達(dá)。足底注射甲醛后各時(shí)間點(diǎn)組與Control組相比，HO-1蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，表現(xiàn)為HO-1蛋白條帶增寬，HO-1與β-actin積分光密度（integrated o

6、ptical density，IOD）比值升高；其中以F24h組HO-1表達(dá)升高最為明顯，達(dá)到峰值。足底注射甲醛后72小時(shí)，脊髓后角左、右兩側(cè)的HO-1表達(dá)較F24 h組明顯降低，但仍高于Control組水平。各時(shí)間點(diǎn)左、右兩側(cè)脊髓后角比較，HO-1蛋白表達(dá)無明顯差異。
　　 2.HO/CO在甲醛炎性痛誘導(dǎo)大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡中的作用
　　 健康雄性Sprague-Dawley大鼠30只，體重260～280克，隨機(jī)分成5組

7、，分別為正常對(duì)照組（Control組）、甲醛組（F組）、甲醛+溶劑DMSO組（F+DMSO組）、甲醛+ZnppⅨ50μg組（F+50μgz組）、甲醛+ZnppⅨ100μg組（F+100μg Z組），每組6只動(dòng)物。甲醛+DMSO組和甲醛+各劑量ZnppⅨ組動(dòng)物均預(yù)先鞘內(nèi)注射DMSO或HO-1抑制劑ZnppⅨ溶劑，30分鐘后足底注射甲醛，于注射甲醛后72小時(shí)斷頭取脊髓腰5（L5）節(jié)段，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)脊髓神經(jīng)元凋亡率。
　　 結(jié)

8、果發(fā)現(xiàn)：與F組比較，F(xiàn)+DMSO組動(dòng)物自發(fā)痛反應(yīng)程度無明顯改變，表明鞘內(nèi)注射溶劑DMSO對(duì)動(dòng)物自發(fā)痛反應(yīng)無明顯影響；在F+50ug Z組和F+100μgZ組動(dòng)物中觀察到，預(yù)先鞘內(nèi)注射50μg或100μgZnppⅨ，均可使甲醛誘導(dǎo)的自發(fā)痛反應(yīng)程度明顯降低，并且鞘內(nèi)注射ZnppⅨ對(duì)自發(fā)痛反應(yīng)的抑制程度隨著ZnppⅨ劑量增大而更加顯著。
　　 流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示：Control組大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡率較低。與Control組比較，F(xiàn)組

9、大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡率明顯升高，F(xiàn)+DMSO組與F組相比，大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡率無明顯差別，表明鞘內(nèi)注射溶劑DMSO對(duì)大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡率無明顯影響；F+50μg Z組大鼠和F組大鼠比較，脊髓神經(jīng)元凋亡率無明顯差異，但增大ZnppⅨ劑量，預(yù)先鞘內(nèi)注射100μg ZnppⅨ，則可使F+100μg Z組大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡率明顯升高；這一結(jié)果表明，甲醛炎性痛誘導(dǎo)的HO/CO系統(tǒng)活動(dòng)增強(qiáng)可以抑制神經(jīng)元凋亡過程。
　　 3.結(jié)論