豬傳染性胃腸炎病毒M蛋白與宿主細(xì)胞相互作用蛋白的篩選鑒定.pdf

1、豬傳染性胃腸炎（Porcine transmissible gastroenteritis, TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)引起的一類豬高度傳染性疾病，尤其是冬季和早春寒冷季節(jié)，呈地方性暴發(fā)流行，臨床癥狀主要以嚴(yán)重腹瀉、嘔吐及脫水為特征，不同年齡及品種的豬均可感染，尤其是2周齡以內(nèi)哺乳仔豬，死亡率達(dá)100％。TGEV滅活和減毒活疫苗在亞洲已廣泛應(yīng)用于生

2、產(chǎn)，但近年來在已免疫疫苗的豬場(chǎng)仍有致病性TGEV暴發(fā)流行，因此有必要研制有效的疫苗及開展病毒致病機(jī)制相關(guān)研究。病毒-宿主相互作用的研究可鑒定出致病基因，通過修飾或缺失致病基因來減弱病毒的毒力，有助于候選疫苗和抗病毒藥物的研制以防控TGEV的感染。
　　膜蛋白(M)是TGEV重要結(jié)構(gòu)蛋白，主要包埋在病毒脂質(zhì)囊膜中，是病毒裝配期間構(gòu)成冠狀病毒顆粒的重要組成部分。同時(shí)，M蛋白高度保守，其在 TGEV的致病性和病毒復(fù)制及轉(zhuǎn)錄過程中也發(fā)揮重

3、要作用。M蛋白與S、N及E蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基中間體相互作用，促進(jìn)病毒粒子的裝配和出芽。M-M蛋白相互作用形成同源低聚體，是冠狀病毒囊膜形成的基礎(chǔ)，膜結(jié)合同樣需要高效的M-M相互作用。但M蛋白與宿主蛋白的相互作用及其對(duì)TGEV感染的調(diào)控過程仍未知。為此本研究以TGEV M蛋白為研究對(duì)象，采用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選宿主細(xì)胞豬小腸上皮細(xì)胞(pIECs)與 M蛋白互作的宿主蛋白；GST pull-down技術(shù)驗(yàn)證候選蛋白與M蛋白的互作。主要研究?jī)?nèi)

4、容如下：
　　（1）豬小腸上皮細(xì)胞(pIECs) cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及鑒定
　　提取pIECs的細(xì)胞總RNA，SMART法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，去除短片段后定與酵母文庫(kù)表達(dá)載體pGADT7共轉(zhuǎn)化至酵母菌株Y187，成功構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫(kù)。對(duì)文庫(kù)質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，酵母文庫(kù)滴度為5.0×107 cfu/mL，插入片段在500-2000 bp。結(jié)果表明，本試驗(yàn)成功構(gòu)建了pIECs酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，且文庫(kù)質(zhì)量較高，可用于M蛋

5、白互作蛋白的篩選。
　?。?）TGEV M蛋白誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
　　以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存的質(zhì)粒pFastBacTMDUAL-M為模板，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增 M基因全長(zhǎng)序列，然后定向克隆至酵母誘餌表達(dá)載體 pGBKT7，轉(zhuǎn)化至酵母菌株Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞。對(duì)構(gòu)建的誘餌載體pGBKT7-M進(jìn)行細(xì)胞毒性、自轉(zhuǎn)錄激活活性及其在酵母細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況的檢測(cè)。結(jié)果表明，空載體 pGBKT7和誘餌載體pGBKT7-M的菌落大小

6、和數(shù)量基本一致，構(gòu)建的誘餌載體無細(xì)胞毒性；誘餌載體pGBKT7-M在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上沒有菌落生長(zhǎng)，說明無自激活活性；Western blot結(jié)果可見蛋白條帶約為50 kDa的融合蛋白，說明誘餌載體在酵母細(xì)胞Y2HGold中正確表達(dá)。構(gòu)建的誘餌載體pGBKT7-M可用于pIECs酵母雙雜交cDNA文庫(kù)互作蛋白的篩選。
　?。?）酵母雙雜交篩選與M蛋白相互作用的蛋白
　　根據(jù)Clontech

7、公司Matchmaker?Gold Yeast Two-Hybrid System操作手冊(cè)，以TGEV M基因構(gòu)建酵母誘餌質(zhì)粒pGBKT7-M，與pIECs酵母雙雜交cDNA文庫(kù)進(jìn)行雙雜交篩選， SD/-Trp/-Leu/-Ade、SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His、SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/AbA營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上三輪篩選，并對(duì)篩選出的蛋白進(jìn)行Blast分析。最終篩選獲得7種可能與M蛋白互作

8、的宿主蛋白。其中，EIF4A2蛋白的重復(fù)性較高，且根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)表明， EIF4A2參與促進(jìn)病毒增殖及病毒蛋白合成。因此EIF4A2將作為候選蛋白進(jìn)行下一步研究及驗(yàn)證。
　　(4) GST pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證M蛋白與候選蛋白的相互作用
　　本部分利用GST pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證M蛋白與候選蛋白EIF4A2的相互作用。構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-4T-M融合表達(dá)GST-M蛋白，Glutathione Sepharos

9、e4B瓊脂糖珠進(jìn)行純化；將 EIF4A2基因片段連接到原核表達(dá)載體 pET-28a構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-EIF4A2，Ni親和層析柱對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化。然后將GST-M融合蛋白作為誘餌蛋白固化在谷胱甘肽親和樹脂上，再用純化后的 His-EIF4A2蛋白溶液過柱，通過蛋白間的互作捕獲候選蛋白，反復(fù)洗脫后經(jīng)SDS-PAGE，Western blot檢測(cè)M蛋白與候選蛋白EIF4A2間的互作。結(jié)果表明，M蛋白與候選蛋白EIF4A2確實(shí)存在特異