組成型表達(dá)雞傳染性法氏囊病毒vp2基因重組乳酸菌的構(gòu)建及免疫原性分析.pdf

1、傳染性法氏囊病(IBD)是由傳染性法氏囊病毒(IBDV)引發(fā)的一種雞的免疫抑制性傳染病，該病給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究中，利用乳酸菌表達(dá)載體pPG612構(gòu)建了表達(dá)IBDV免疫原性蛋白vp2的重組表達(dá)質(zhì)粒，并分別在L.plantarum，L.pentoses，和L.casei393三株乳酸菌中進(jìn)行表達(dá)。pPG612載體是一種表面展示載體，該載體中包含HCE組成型啟動(dòng)子和PgsA錨定蛋白，同時(shí)為了提高vp2蛋白的表達(dá)量，本研究在該

2、載體中插入了T7g10增強(qiáng)子。本研究對高效制備表達(dá)vp2蛋白的陽性重組乳酸菌策略進(jìn)行了改善，主要評價(jià)指標(biāo)如下:OD600值處于0.4-0.5，重組質(zhì)粒含量為2μl-6μl（100ng/μl），電壓為2.3-2.4 kv/cm。結(jié)果顯示，有兩種重組質(zhì)粒在三種乳酸菌中均表現(xiàn)出高電轉(zhuǎn)化率，即(i) pPG612-HCE-PgsA-vp2-rrnBT1T2，(ii) pPG612-HCE-T7g10-PgsA-vp2-rrnBT1T2，之后的酶

3、切鑒定和PCR鑒定也都均證實(shí)了該結(jié)果。該方法較之前使用的構(gòu)建重組乳酸菌的方法更加簡單且更加高效。
　　本研究還分別對三株含有pPG612-vp2(pPG612-HCE-PgsA-vp2-rrnBT1 T2)和pPG612-T7g10-vp2（pPG612-HCE-T7g10-PgsA-vp2-rrnBT1T2）重組質(zhì)粒的重組乳酸菌作為口服疫苗的免疫原性和針對IBDV的保護(hù)率進(jìn)行了評價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，vp2蛋白成功的獲得了表達(dá)并展示

4、在各重組乳酸菌的表面，將這些重組乳酸分別命名如下，LPL/pPG612-vp2(PL)，LPL/pPG612-T7g10-vp2(TL)，LPE/pPG612-vp2(PE), LPE/pPG612-T7g10-vp2(TE),LC/pPG612-vp2(PC)和LC/pPG612-T7g10-vp2(TC)。其中，含有pPG612-T7g10-vp2質(zhì)粒的重組菌的vp2蛋白表達(dá)量較高，說明T7g10增強(qiáng)子能夠有效提高vp2蛋白在乳酸菌

5、中的表達(dá)水平。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，口服免疫后，LPL/pPG612-T7g10-vp2株乳酸菌能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫反應(yīng)以及更高的免疫保護(hù)率(87.5％)。通過本研究可以證明，重組乳酸菌系統(tǒng)作為口服疫苗可以刺激動(dòng)物產(chǎn)生較強(qiáng)的抗體水平， pPG612-HCE-T7g10-PgsA-vp2-rrnBT1 T2免疫組產(chǎn)生的抗體水平顯著高于pPG612-HCE-PgsA-vp2-rrnBT1T2免疫組，并且L.plantarum菌株免疫組的免

6、疫保護(hù)率高于L.casei免疫組和L.pentoses免疫組。同時(shí)，L.casei免疫組的保護(hù)率高于L.pentoses免疫組。
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，在vp2免疫組中檢測到大量的T細(xì)胞，在IBDV攻毒組中也檢測到數(shù)量增多。與空白對照組相比，所有免疫組的CD4+和CD8+T細(xì)胞均顯著性增高，其中pPG612-HCE-T7g10-PgsA-vp2-rrnBT1T2免疫組的CD4+和CD8+T細(xì)胞比例高于pPG612-HCE-PgsA-vp

7、2-rrnBT1T2免疫組。TL免疫組中CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的分化率分別為13.3％和21.0％，高于PL免疫組的10.4％和14.0％; TC免疫組CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的分化率分別為11.4％和20.9％，高于PC免疫組的7.2％和11.5％; TE免疫組CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的分化率分別為8.3％和16.7％，高于PE組的7.5％和13.5％。所有免疫組的CD8+T細(xì)胞分化率均高于CD4+T細(xì)胞。CD8+

8、T細(xì)胞屬于細(xì)胞毒性T細(xì)胞，可以裂解感染病毒的細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和同種異體移植物，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在細(xì)胞免疫反應(yīng)的檢測結(jié)果中，重組L.plantarum菌株免疫組的CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的分化率高于重組L.casei菌株組和重組L.pentoses菌株組。pPG612-HCE-T7g10-PgsA-vp2-rrnBT1T2免疫組產(chǎn)生的IFN-γ，IL-2和IL-4細(xì)胞因子水平高于pPG612-HCE-PgsA-vp2-rr

9、nBT1T2免疫組;其它數(shù)據(jù)顯示，IFN-γ水平高于IL-2水平，IL-2水平高于IL-4水平;重組L.plantarum菌株免疫組較其他兩個(gè)重組菌免疫組能夠刺激產(chǎn)生更高水平的Th1和Th2型細(xì)胞因子，并且重組L.casei菌株免疫組刺激產(chǎn)生Th1和Th2型細(xì)胞因子水平高于重組L.pentoses菌株免疫組。IFN-γ和IL-2等Th1型細(xì)胞因子和細(xì)胞免疫相關(guān)，IL-4等Th2型細(xì)胞因子和體液免疫相關(guān)。本研究得出結(jié)論，含有pPG612-