表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2蛋白重組馬立克病毒CV1988-Rispens轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建.pdf

1、傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由雞傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的雞和火雞的一種急性、高度接觸性傳染病。我國(guó)目前廣泛采用中等毒力活疫苗防治IBD，但每年由IBD造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大，超強(qiáng)毒株的出現(xiàn)更是對(duì)中國(guó)養(yǎng)禽業(yè)防治IBD構(gòu)成了巨大威脅。使用毒力強(qiáng)的活疫苗，造成了更嚴(yán)重的法氏囊病理?yè)p傷和免疫抑制。如此長(zhǎng)期大量的使用毒力不斷增

2、強(qiáng)的活疫苗，被認(rèn)為是變異株和超強(qiáng)毒株出現(xiàn)的一個(gè)重要原因。
　　 長(zhǎng)期以來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者一直都在嘗試?yán)梅肿由飳W(xué)和生物技術(shù)的方法研制IBD新型疫苗，近年來(lái)這些嘗試和努力已經(jīng)取得了可喜的研究進(jìn)展。馬立克病毒CVI988/Rispens疫苗株作為病毒活載體的安全性和有效性已經(jīng)得到證實(shí)。本研究以CVI988/Rispens疫苗株為載體，在其基因組的復(fù)制完全非必需區(qū)US2插入IBDV-VP2抗原保護(hù)性基因，并在CMV啟動(dòng)子的控制下得以穩(wěn)定表

3、達(dá)，通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)初步證實(shí)獲得了無(wú)報(bào)告基因的表達(dá)IBDV-VP2蛋白重組馬立克病毒CVI988/Rispens。
　　 1馬立克病毒CVI988/Rispens疫苗株通用轉(zhuǎn)移載體pUC-VP2-US2的構(gòu)建
　　 通過(guò)PCR方法擴(kuò)增出馬立克病毒(CVI988/Respense株)基因組復(fù)制完全非必需片段US2區(qū)的左翼和右翼，分別命名為US2L和US2R。將US2L和US2R先后克隆入pUC18載體，陽(yáng)性克隆命名為p

4、UC-US2。然后將完整的法氏囊病毒VP2基因表達(dá)盒(包括CMV啟動(dòng)子，VP2 ORF以及PolyA信號(hào))，以限制性?xún)?nèi)切酶XholⅠ和BglⅡ克隆入pUC-US2，獲得不含任何報(bào)告基因的重組質(zhì)粒pUC-VP2-US2。在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞(CEFs)。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該重組質(zhì)?？梢栽贑EFs中表達(dá)法氏囊病毒VP2蛋白。這為下一步將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染感染馬立克病毒的CEFs，獲得表達(dá)法氏囊病毒VP2蛋白的重組

5、馬立克病毒奠定了基礎(chǔ)。
　　 2重組轉(zhuǎn)移載體pUC-VP2-US2的瞬時(shí)表達(dá)及rMDV的初步檢測(cè)
　　 采用傳統(tǒng)細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制了CEF的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，確定了轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞的最佳時(shí)間。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法對(duì)轉(zhuǎn)染時(shí)機(jī)、脂質(zhì)體與質(zhì)粒的體積質(zhì)量比以及轉(zhuǎn)染的細(xì)胞密度等進(jìn)行了摸索。確定了重組轉(zhuǎn)移載體最佳轉(zhuǎn)染條件為在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上均勻鋪滿(mǎn)2×105細(xì)胞/孔，24小時(shí)后用Lipofectamine2000 reagent1.5μl和pUC

6、-VP2-US2質(zhì)粒1.0μg進(jìn)行轉(zhuǎn)染。最佳轉(zhuǎn)染條件的確定增加了重組轉(zhuǎn)移載體與馬立克病毒發(fā)生細(xì)胞內(nèi)同源重組產(chǎn)生重組馬立克病毒的可能性。在此轉(zhuǎn)染條件下對(duì)感染馬立克病毒CVI988的CEF細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pUC-VP2-US2，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)同源重組。轉(zhuǎn)然后4天將病毒空斑消化后，均勻感染兩塊96孔板。4天后通過(guò)用IBDV-VP2單克隆抗體185做間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，初步檢測(cè)到了表達(dá)IBDV-VP2蛋白的重組馬立克病毒陽(yáng)性空斑，證明轉(zhuǎn)移表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建