人類BMP-2基因在兔骨髓MSCs的表達及其作用機制研究.pdf

1、目的：(1)分離兔骨MSCs，體外培養(yǎng)擴增，觀察其生物學性狀及條件培養(yǎng)下成骨分化情況。(2)提取HBMP-2 cDNA，構建其真核表達載體pIRES2-EGFP-hBMP2。(3)將pIRES2-EGFP-hBMP2轉染兔MSCs，觀察}1BMP-2 cDNA在兔MSCs的表達情況及其誘導成骨情況，探討其作用機制。 方法：(1)抽取兔髂骨及脛骨的骨髓液，密度梯度離心法分離出MSCs，體外純化鑒定培養(yǎng)擴增，相差顯微鏡下觀察細胞

2、的生物學性狀。取第2代MSCs在條件培養(yǎng)基下成骨誘導，測定其ALP活性及成骨礦化情況。(2)RT-PCR方法獲取人骨肉瘤細胞中的hBMP-2 cDNA，將此片段重組到pMDl8-T克隆載體中，轉化大腸桿菌DH5 a篩選擴增，并測序目的基因；酶切pMDl8T-BMP2中的hBMP-2 cDNA，定向克隆到pIRES2-EGFP真核表達載體中，篩選擴增并鑒定重組質粒。 (3)用電穿孔法將pIRES2-EGFP-hBMP2轉染至兔MSCs中

3、，熒光顯微鏡下及流式細胞學檢查觀察轉染效果、檢測轉染效率，定量RT-PCR方法觀察hBMP-2 cDNA在兔MSCs中的轉錄情況，免疫組織化學及western b10t方法檢測MSCs中hBMP-2蛋白表達情況。連續(xù)培養(yǎng)轉染后的兔MSCs，檢測ALP活性及成骨礦化情況，觀察表達的hBMP-2蛋白功能情況。 結果：(1)兔MSCs為均一的成纖維形細胞，漩渦狀貼壁生長，增殖成力強。在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)，兔MSCs具有向成骨細胞表型分化

4、能力，細胞內ALP活性明顯增強，可在兩周時形成鈣化結節(jié)。(2)從人骨肉瘤細胞中提取到hIBMP-2 cDNA，經測序后證明為hBMF-2基因全編碼序列，并成功地構建hBMP-2 cDNA的真核表達載體。(3)電穿孔方法可以將質粒pIRES2-EGFP-laBMP2轉染至兔MSCs中，熒光顯微鏡下觀察到強綠色熒光蛋白表達，流式細胞儀檢測轉染效率為(42.7±2.1)％。在轉染24小時后定量RT-PCR方法可以檢測到hBMP-2 cDNA在

5、兔MSC中的逆轉錄片斷，免疫組織化學及western blot方法均觀察到兔MSC中有hBMP-2蛋白。培養(yǎng)電轉染后的兔MSCs，增殖能力較未轉化組強，其細胞內ALP活性增強，可形成鈣化結節(jié)。 結論：(1)密度梯度離心法可分離到兔MSCs，體外培養(yǎng)性狀穩(wěn)定，增殖力強，具有成骨分化潛能，是骨組織工程中的理想種子細胞。 (2)體外基因重組技術可以成功地獲取hBMP-2 eDNA并構建其真核表達載體。(3)hBMP-2 eDNA可在