比較重組牛野生型和突變型脂多糖結(jié)合蛋白對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的牛乳腺上皮細(xì)胞的影響.pdf

1、脂多糖結(jié)合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)對(duì)識(shí)別細(xì)菌成分，比如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，發(fā)揮重要的作用。本實(shí)驗(yàn)通過真核表達(dá)系統(tǒng)獲得體外重組牛脂多糖結(jié)合蛋白（recombinant bovine lipopolysaccharide binding protein，RBLBP），包括野生型LBP(wild LBP，WT-LBP)和突變型LBP(mutant

2、LBP, MU-LBP)。體外培養(yǎng)牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells，BMECs)，并用LPS誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，用不同濃度的RBLBP處理炎癥細(xì)胞，并用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。通過基因芯片技術(shù)比較WT-LBP和MU-LBP對(duì)體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)錄水平上的不同影響。本次研究對(duì)進(jìn)一步探討突變LBP在奶牛乳房炎的作用以及防治有重要的作用。
　　本實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)

3、部分:
　　1 RBLBP的表達(dá)與純化
　　本實(shí)驗(yàn)在哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)獲得重組的野生型和突變型LBP，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供材料。首先，從基因庫中查找目標(biāo)蛋白野生LBP和第三外顯子發(fā)生點(diǎn)突變(4619 G→A)的突變LBP的cDNA序列。合成設(shè)計(jì)好的目的基因。其次，將LBP基因亞克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1上，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并測(cè)序驗(yàn)證其正確性。最后，利用轉(zhuǎn)染劑將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入哺乳細(xì)胞HEK293，通過瞬時(shí)表達(dá)產(chǎn)生LBP蛋白，去除內(nèi)

4、毒素，通過SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè)并驗(yàn)證LBP蛋白的正確性。結(jié)果表明，正確構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒，重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，獲得純化的WT-LBP和MU-LBP。
　　2體外培養(yǎng)BMECs并且比較WT-LBP和MU-LBP對(duì)由LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞存活率和凋亡率的影響
　　本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菣z測(cè)不同濃度的RBLBP對(duì)由LPS誘導(dǎo)的炎癥BMEC的存活率和凋亡率的影響，依此探究出對(duì)細(xì)胞存活率和凋亡率的影響相對(duì)較大

5、的RBLBP濃度，為后續(xù)的基因芯片實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。結(jié)果顯示，用不同濃度的RBLBP（1，5，10和15μg/mL）處理炎癥上皮細(xì)胞12小時(shí)，結(jié)果顯示5μg/mL的RBLBP能夠增加由LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞的凋亡率，并且MU-LBP比WT-LBP能夠誘導(dǎo)更高的細(xì)胞凋亡率。結(jié)果表明，5μg/mL的RBLBP能夠使細(xì)胞的炎癥反應(yīng)更劇烈，因此我們選用5μg/mL的RBLBP作為基因芯片實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
　　3基因芯片技術(shù)比較WT-LBP與M

6、U-LBP對(duì)炎癥乳腺上皮細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)錄水平上的影響
　　LBP具有致炎和抗炎雙重作用，發(fā)揮何種功能則是依賴于血液中LBP濃度和其自身獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)及功能位點(diǎn)。用相同濃度（5μg/mL）且不同蛋白類型的RBLBP處理由LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞，用基因芯片技術(shù)比較WT-LBP與MU-LBP對(duì)細(xì)胞炎癥在基因轉(zhuǎn)錄水平上的差異性。基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)分析的結(jié)果顯示，在由5μg/mL的MU-LBP處理的炎癥細(xì)胞和未用LBP處理的炎癥細(xì)胞之間差

7、異表達(dá)的基因有2306個(gè)。與此同時(shí)，在由5μg/mL的WT-LBP處理的炎癥細(xì)胞和未用LBP處理的炎癥細(xì)胞之間差異表達(dá)的基因是1585個(gè)。這些表明相同濃度的RBLBP，MU-LBP比WT-LBP能使細(xì)胞的炎癥反應(yīng)更劇烈，與之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果即相同濃度的MU-LBP比WT-LBP使炎癥細(xì)胞的凋亡率更高的結(jié)果一致。GO和KEGG分析結(jié)果顯示這些差異表達(dá)的基因參與到不同的調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的信號(hào)通路中。因此，我們預(yù)測(cè)攜帶這種突變型LBP的個(gè)體感染陰性菌后