PPARγ激動劑對脂多糖誘導腎小管上皮細胞分泌趨化因子的影響及機制研究.pdf

1、腎間質(zhì)炎癥反應是導致腎間質(zhì)纖維化的重要因素，在腎臟病進展過程中發(fā)揮著非常重要的作用。研究表明，包括白介素-8（interleukin-8, IL-8）和單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1, MCP-1）在內(nèi)的趨化因子與腎間質(zhì)炎癥損傷有關(guān)。在糖尿病大鼠和5/6腎切除大鼠模型中，腎間質(zhì)IL-8和 MCP-1表達顯著增加。腎臟固有細胞之一--腎小管上皮細胞，在結(jié)構(gòu)上與小管液和腎間質(zhì)緊密接觸, 研

2、究顯示在細胞因子及刺激物作用下通過分泌趨化因子而積極參與腎間質(zhì)病變，被認為是腎間質(zhì)趨化因子的主要來源之一。HK-2細胞是人近端腎小管上皮細胞系，保留了腎小管上皮細胞的基本形態(tài)和生物學特性。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（γ，PPARγ）是一類配體依賴性核轉(zhuǎn)錄因子超家族成員之一，15-脫氧前列腺素J2（J2, 15d-PGJ2）和羅格列酮（RGL）分別是PPARγ的天然激動劑和人工合成激動劑。近年來，在糖尿病腎病和非糖尿病腎病動物模型中均發(fā)

3、現(xiàn)PPARγ激動劑可減輕腎間質(zhì)炎癥反應，延緩腎間質(zhì)纖維化過程。PPARγ激動劑減輕腎間質(zhì)炎癥反應是否與抑制腎小管上皮細胞分泌趨化因子有關(guān)及進一步分子機制尚未探明。脂多糖(LPS)是一種重要的致炎因子，可導致內(nèi)毒素血癥，加快狼瘡性腎炎和IgA腎病動物模型的腎臟損害。
　　 本研究以腎小管上皮細胞（HK-2細胞）為研究對象，觀察15d-PGJ2對LPS誘導的趨化因子表達的影響。結(jié)果提示：與對照組相比，單獨LPS刺激4h使IL-8和M

4、CP-1mRNA分別升高（5.27±1.83）和(5.04±1.33)倍。與單獨LPS組相比，15d-PGJ2+LPS組IL-8和MCP-1mRNA分別下降74.23％和79.42％；腎間質(zhì)炎癥反應是導致腎間質(zhì)纖維化的重要因素，在腎臟病進展過程中發(fā)揮著非常重要的作用。研究表明，包括白介素-8（IL-8）和單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）在內(nèi)的趨化因子與腎間質(zhì)炎癥損傷有關(guān)。在糖尿病大鼠和5/6腎切除大鼠模型中，腎間質(zhì)IL-8和 MCP-

5、1表達顯著增加。腎臟固有細胞之一--腎小管上皮細胞，在結(jié)構(gòu)上與小管液和腎間質(zhì)緊密接觸, 研究顯示在細胞因子及刺激物作用下通過分泌趨化因子而積極參與腎間質(zhì)病變，被認為是腎間質(zhì)趨化因子的主要來源之一。HK-2細胞是人近端腎小管上皮細胞系，保留了腎小管上皮細胞的基本形態(tài)和生物學特性。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（γ，PPARγ）是一類配體依賴性核轉(zhuǎn)錄因子超家族成員之一，15-脫氧前列腺素J2（J2, 15d-PGJ2）和羅格列酮（RGL）分別

6、是PPARγ的天然激動劑和人工合成激動劑。近年來，在糖尿病腎病和非糖尿病腎病動物模型中均發(fā)現(xiàn)PPARγ激動劑可減輕腎間質(zhì)炎癥反應，延緩腎間質(zhì)纖維化過程。PPARγ激動劑減輕腎間質(zhì)炎癥反應是否與抑制腎小管上皮細胞分泌趨化因子有關(guān)及進一步分子機制尚未探明。以往研究已顯示，15d-PGJ2可抑制TNF-α誘導巨噬細胞/單核細胞分泌誘導性一氧化氮合酶（iNOS）和白介素-6（Interleukin -6，IL-6）等炎癥介質(zhì)，這一作用是否依賴于

7、PPARΓ研究較少。為了進一步研究15d-PGJ2對腎小管上皮細胞分泌趨化因子的影響是否依賴于PPARΓ，本研究第二部分用RNAi技術(shù)沉默HK-2細胞中PPARΓ表達。實驗結(jié)果顯示：在PPARΓ沉默的HK-2細胞中，PPARΓ蛋白表達量是正常HK-2細胞的27.74％， 15d-PGJ2預處理2h仍能顯著抑制LPS所致的IL-8和MCP-1表達增加，與單獨LPS組相比， 細胞中IL-8 和MCP-1mRNA分別下降59.21％和44.0

8、8％；培養(yǎng)上清中IL-8和MCP-1分別下降47.11％和39.40％（均p<0.05）。研究發(fā)現(xiàn)15d-PGJ2可顯著抑制LPS誘導的IκB磷酸化和NF-κB核易位，且此抑制作用不依賴于PPARΓ。表明15d-PGJ2作用于HK-2細胞，可直接抑制LPS誘導的IκB磷酸化，減少IκB的泛素化降解，進而抑制NF-κB核易位，減少下游IL-8和MCP-1轉(zhuǎn)錄，且以上作用不依賴于核受體PPARγ。本研究還發(fā)現(xiàn)RGL的抗炎機制與15d-PGJ

9、2不同：在PPARγ沉默的HK-2細胞中，與單獨LPS組相比，RGL+LPS組 IL-8 mRNA和蛋白僅分別下降18.16％和11.39％，MCP-1mRNA和蛋白僅分別下降16.83％和11.86％，差異均無統(tǒng)計學意義。且RGL對LPS誘導的IκB磷酸化和NF-κB核易位無明顯影響。NCoR（nuclear receptor corepressor）屬于核受體輔抑制因子，與PPARγ結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄活性。本研究第三部分用特異性siRN

10、A沉默腎小管上皮細胞NCoR，觀察NCoR對RGL抑制趨化因子表達的影響。結(jié)果顯示在NCoR沉默的HK-2細胞中，與對照組相比，單獨LPS 組IL-8和MCP-1表達均顯著增加（p<0.001）；與單獨LPS刺激相比，RGL+LPS組IL-8 mRNA和蛋白僅分別下降32.22％和19.33％，MCP-1 mRNA和蛋白分別僅分別下降11.83％和10.77％，差異無統(tǒng)計學意義。提示沉默NCoR可抵消RGL對趨化因子表達的抑制作用。以往

11、研究表明NCoR/HDAC3復合體從NF-κB的DNA結(jié)合位點解離對于激活NF-κB靶基因轉(zhuǎn)錄是必需的。研究表明肝X受體(LXRs)和糖皮質(zhì)激素受體(GR) SUMO化(SUMO)，可抑制NCoR被19S蛋白酶體降解，進而抑制NCoR/HDAC3復合體從NF-κB靶基因啟動子區(qū)清除，發(fā)揮抗炎作用。本研究表明，RGL顯著降低NF-κB DNA結(jié)合活性，且可顯著抑制LPS誘導的NCoR降解。提示RGL抑制趨化因子表達的作用依賴于NCoR，即

12、RGL激活 PPARγ后抑制NCoR的降解，使NCoR/HDAC3復合體穩(wěn)定結(jié)合于NF-κB的DNA結(jié)合位點，進而阻斷NF-κB介導的炎癥因子轉(zhuǎn)錄。PPARγ分子結(jié)構(gòu)也存在SUMO化位點，在信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活子（STAT1）的抑制蛋白1(PIAS1)作用下發(fā)生SUMO化。為進一步觀察RGL抑制趨化因子表達的作用是否與PPARγ SUMO化有關(guān)，本研究用特異性siRNA沉默HK-2細胞PIAS1表達。結(jié)果顯示，在PIAS1沉默的HK-2細

13、胞中，與對照組相比，單獨LPS組IL-8和MCP-1表達均顯著增加；與單獨LPS刺激相比，RGL+LPS組IL-8mRNA和蛋白水平僅分別下降27.41％和13.33％，MCP-1 mRNA和蛋白僅分別下降20.16％和7.7％，差異無統(tǒng)計學意義。可見阻斷PPARγ SUMO化， RGL的抗炎作用明顯被抑制，提示RGL的抗炎機制與LXRs和GR相似，即RGL激活PPARγ SUMO化，抑制NCoR被蛋白酶體降解，使NCoR穩(wěn)定結(jié)合于NF

14、-κB 的DNA結(jié)合位點，抑制下游炎癥因子轉(zhuǎn)錄。
　　 本研究首次證實PPARγ激動劑可顯著抑制LPS誘導腎小管上皮細胞分泌IL-8和MCP-1。PPARγ天然激動劑--15d-PGJ2可直接抑制LPS誘導的IκB磷酸化，進而阻斷NF-κB核易位，以上作用不依賴于PPARγ。與15d-PGJ2不同，PPARγ人工合成激動劑--RGL對趨化因子的抑制作用依賴于PPARγ，對NF-κB核易位無明顯影響，而是通過激活PPARγ，促進其