雜色曲霉素對食管鱗狀上皮細胞影響的實驗研究.pdf

1、目的：雜色曲霉素(sterigmatocystin，ST)是致癌性真菌毒素，是我國食管癌高發(fā)區(qū)居民飲食中的主要污染真菌毒素之一。本研究室以往研究發(fā)現(xiàn)，采用河北省太行山區(qū)居民正在使用的酸菜湯樣品、雜色曲霉菌素污染的玉米面以及純化的雜色曲霉素灌胃的動物誘癌實驗研究中，可以見到肺腺癌和胃不典型增生，但均未發(fā)現(xiàn)誘發(fā)食管癌。雜色曲霉素作為食管癌的病因尚缺乏足夠的證據(jù)。 機體的免疫功能狀態(tài)是影響腫瘤發(fā)生的一個重要因素，惡變細胞可通過多種機制

2、逃避機體的免疫監(jiān)視，使機體的免疫系統(tǒng)出現(xiàn)障礙而無法對腫瘤細胞進行識別和殺傷。本研究室以往研究證實，ST可誘導(dǎo)人外周血單核細胞(humanperipheralbloodmononuclearcell，HPBMc)中的淋巴細胞發(fā)生凋亡，并在一定時間(2～48小時)和劑量(0.125～2.0mg/L)范圍內(nèi)呈正相關(guān)，對HPBMc細胞表面HLA-Ⅰ分子表達呈劑量依賴性下降。 有研究發(fā)現(xiàn)我國食管癌高發(fā)區(qū)食管癌組織與正常組織相比，HLA-Ⅰ

3、表達下降，并且HLA-Ⅰ的下調(diào)與病理分級、淋巴轉(zhuǎn)移等呈正相關(guān)。為了從免疫方面進一步探討ST在食管癌發(fā)生中的可能作用，進行了以下實驗： 1應(yīng)用細胞培養(yǎng)、免疫組化、流式細胞術(shù)方法研究了ST對體外培養(yǎng)的人食管鱗狀上皮細胞HLA-Ⅰ表達的影響。 2為探討ST處理食管鱗狀上皮HLA-Ⅰ表達影響的可能機制用細胞培養(yǎng)、WestonBolt和RT-PCR相結(jié)合的辦法，研究了ST對體外培養(yǎng)的人食管鱗狀上皮細胞TAP1、LMP2表達的影響。

4、 3為探討食管異常情況下，ST對食管鱗狀上皮致癌的可能作用，應(yīng)用病理觀察、免疫組化和原位雜交的方法研究了ST處理反流性食管炎大鼠食管鱗狀上皮PCNA、TAP1、LMP2蛋白和TGFβ2mRNA的表達情況。 結(jié)果：1雜色曲霉素對人食管鱗狀上皮細胞HLA-Ⅰ表達的影響 免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果表明，HLA-Ⅰ陽性反應(yīng)定位于體外培養(yǎng)食管上皮細胞膜和細胞漿。各實驗組每高倍視野平均陽性細胞數(shù)結(jié)果分別為空白對照，13.4

5、7±7.08、溶媒對照14.51±5.68、ST濃度從0.125mg/L至2.0mg/L分別為16.37±6.30、15.80±8.00、8.14±4.90、7.81±4.60、3.84±0.97；FCM定量檢測細胞HLA-Ⅰ表達情況分別為空白對照，1.0320±0.0096、溶媒對照1.0267±0.013、ST濃度從0.125mg/L至2.0mg/L分別為1.0200±0.0227、1.012±0.0104、0.994±0.0108

6、、0.973±0.0108、0.957±0.0136。免疫組化結(jié)果表明，與正常對照相比，不同濃度雜色曲霉素處理24小時后，較低濃度處理組(0.125、0.25mg/L)人食管鱗狀上皮細胞HLA-Ⅰ表達略有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。較高濃度處理組(0.5、1.0、2.0mg/L)，人食管鱗狀上皮細胞HLA-Ⅰ表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 FCM檢測結(jié)果表明，與正常對照相比，不同濃度雜色曲霉素處理24小時后，較低濃度處理組(0.12

7、5、0.25mg/L)人食管鱗狀上皮細胞HLA-Ⅰ表達略有降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。較高濃度處理組(0.5、1.0、2.0mg/L)，人食管鱗狀上皮細胞HLA-Ⅰ表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。免疫組化結(jié)果表明，與正常對照相比，不同濃度雜色曲霉素處理24小時后，較低濃度處理組(0.125、0.25mg/L)人食管鱗狀上皮細胞HLA-Ⅰ表達略有降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。較高濃度處理組(0.5、1.0、2.0mg/L)，人食管鱗狀上皮細胞HLA

8、-Ⅰ表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 2雜色曲霉素對人食管鱗狀上皮細胞TAP1和LMP2表達的影響 WestonBlot半定量檢測TAP1和LMP2蛋白量表達結(jié)果表明，與正常對照相比，不同濃度雜色曲霉素處理24小時后，較低濃度處理組(0.125、0.25mg/L)人食管鱗狀上皮細胞TAP1和LMP2蛋白表達略有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。較高濃度處理組(0.5、1.0、2.0mg/L)，人食管鱗狀上皮細胞TAP1和LMP2蛋白

9、表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 同樣，半定量RT-PCR檢測TAP1和LMP2mRNA表達結(jié)果表明，與正常對照相比，不同濃度雜色曲霉素處理24小時后，較低濃度處理組(0.125、0.25mg/L)人食管鱗狀上皮細胞TAP1和LMP2mRNA表達略有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。較高濃度處理組(0.5、1.0、2.0mg/L)，人食管鱗狀上皮細胞TAP1和LMP2mRNA表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 3雜色曲霉素對反流性食管炎大

10、鼠食管鱗狀上皮PCNA、TAP1LMP2蛋白和TGFβ2mRNA表達的影響 賁門括約肌部分切除術(shù)加幽門半結(jié)扎術(shù)可成功制備反流性食管炎模型。所有模型組和處理組都出現(xiàn)食管炎的表現(xiàn)，鏡下主要以炎癥和增生為主，有潰瘍形成。光鏡下炎癥評分，處理組與模型組比較，雖然炎癥評分略增高，但各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。光鏡下增生程度評分結(jié)果，處理組與模型組比較，增生程度評分增高，各組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 PCNA陽性表達于反流性食管炎大鼠食

11、管上皮細胞核，呈棕黃色顆粒。對照組表達PCNA增殖指數(shù)為21.50±9.79；模型組PCNA增殖指數(shù)為49.17±18.67；處理組PCNA增殖指數(shù)為70.10±12.55。ST處理組與模型組、對照組比較PCNA指數(shù)明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 TAP1蛋白陽性表達于反流性食管炎大鼠食管上皮細胞漿，呈棕黃色顆粒。對照組，平均陽性細胞率為71.17±6.62；模型組，平均陽性細胞率為36.17±5.31；處理組，平均陽性細胞率為2

12、0.83±7.08。模型組和ST處理組表達明顯降低，尤處理組降低明顯。ST處理組與模型組、對照組比較TAP1蛋白表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 LMP2蛋白陽性表達于反流性食管炎大鼠食管上皮細胞漿，呈棕黃色顆粒。LMP2陽性表達于細胞漿，呈棕黃色顆粒。對照組，平均陽性細胞率為53.83±5.81；模型組，平均陽性細胞率為34.50±6.44；處理組，平均陽性細胞率為22.50±6.72。ST處理組與模型組、對照組比較LMP2蛋

13、白陽性表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 TGFβ2mRNA陽性表達于反流性食管炎大鼠食管上皮細胞漿，呈棕黃色顆粒。對照組，平均陽性細胞率為19.33±5.28；模型組，平均陽性細胞率為53.17±6.77；處理組，平均陽性細胞率為80.00±10.71。ST處理組與模型組、對照組比較TGFβ2mRNA表達明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論：1.在0.125mg/L到2mg/L濃度范圍內(nèi)，ST可劑量依賴地抑制體外培養(yǎng)人食管

14、鱗狀上皮細胞HLA-Ⅰ的表達。 2.在0.125mg/L到2mg/L濃度范圍內(nèi)，ST可劑量依賴地抑制體外培養(yǎng)人食管鱗狀上皮細胞TAP1、LMP2在蛋白和mRNA水平上的表達。 3.ST處理后體外培養(yǎng)人食管鱗狀上皮細胞HLA-Ⅰ表達下降和TAP1、LMP2表達下降密切相關(guān)。 4.賁門括約肌部分切除術(shù)加幽門半結(jié)扎術(shù)可成功制備大鼠反流性食管炎模型。 5.經(jīng)腹腔給予ST處理可明顯增加反流性食管炎大鼠食管鱗狀上皮的

15、增殖活性和增生程度。 6.經(jīng)腹腔給予ST處理可明顯降低反流性食管炎大鼠食管鱗狀上皮TAP1及LMP2在蛋白水平上的表達。 7經(jīng)腹腔給予ST處理可增強反流性食管炎大鼠食管鱗狀上皮TGFβ2mRNA表達。 綜合結(jié)果表明，雜色曲霉素處理可降低體外培養(yǎng)人食管鱗狀上皮細胞HLA-Ⅰ表達，其機制可能與TAP1、LMP2表達下降有關(guān)。經(jīng)腹腔給予ST處理可促進反流性食管炎大鼠食管鱗狀上皮的增殖活性和增生程度，同時降低食管鱗狀上皮