香煙提取物刺激對食管鱗狀上皮細胞miRNA的影響及機制研究.pdf

1、第一章香煙提取物刺激對食管鱗狀上皮細胞miRNA的影響研究
　　目的:篩選與香煙煙霧刺激密切相關(guān)的食管鱗癌miRNA表達譜，為食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的機制研究提供新的方向。
　　方法:使用高通量miRNA芯片方法篩選經(jīng)過香煙提取物刺激后的食管鱗狀上皮細胞miRNA表達譜，結(jié)合相關(guān)研究文獻，確定與吸煙密切相關(guān)的食管鱗癌miRNA表達譜。
　　結(jié)果:從檢測的1223種人類miRNA確定總共有60種miRNA的表達發(fā)生明顯改變，其

2、中13種顯著上調(diào)，47種顯著下調(diào)。結(jié)合相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)，香煙煙霧中的致癌物質(zhì)可能通過刺激以下miRNA及其可能機制導(dǎo)致食管鱗癌的發(fā)生和發(fā)展:miR-101-3p表達下調(diào)反向調(diào)節(jié)COX-2的表達，miR-122-3p、miR-23b-3p異常表達參與p53的調(diào)控;而miR-708-5p、miR-24-1-5p、miR-140-3p、miR-210的表達異常則分別靶向調(diào)控ZEB2、AURKB、PDGFRα、FGFRL1基因。并且，首次在食管鱗癌

3、的研究中發(fā)現(xiàn)miR-101-3p、miR-122-3p、miR-23b-3p、miR-708-5p、miR-24-1-5p、miR-140-3p的異常表達。
　　結(jié)論:本實驗通過miRNA芯片檢測香煙提取物刺激的食管鱗狀上皮細胞，發(fā)現(xiàn)60種異常表達miRNA，這些異常表達的miRNA可能參與吸煙相關(guān)食管疾病的發(fā)生。
　　第二章miR-101-3p參與食管鱗癌發(fā)生機制的初步研究
　　目的:研究miR-101-3p參與食管

4、鱗癌發(fā)生發(fā)展可能的作用機制，明確miR-101-3p可能的靶基因以及相互作用機制。
　　方法:1、運用realtimePCR法定量分析miR-101-3p在人食管鱗癌組織樣本中的表達情況，進一步驗證第一章miRNA芯片結(jié)果;2、采用WesternBlot法檢測人食管鱗癌中COX-2蛋白的表達情況;3、運用miR-101-3p載體構(gòu)建、慢病毒包裝及細胞轉(zhuǎn)染的方法使得食管鱗狀上皮細胞以及食管鱗癌細胞過表達miR-101-3p，并用香煙

5、提取物CSE刺激、特異性COX-2抑制劑NS-398干預(yù)進行對比研究，通過WesternBlot印跡、MTT法、流式細胞檢測、Transwell小室等方法研究細胞內(nèi)miR-101-3p、COX-2及CSE刺激之間的相互關(guān)系。
　　結(jié)果:人食管鱗癌組織樣本中的miR-101-3p表達明顯低于相應(yīng)的癌旁組織，而COX-2蛋白的表達則明顯高于癌旁組織;體外細胞學實驗結(jié)果提示用CSE刺激食管鱗狀上皮細胞后miR-101-3p表達下調(diào)，而C

6、OX-2表達明顯增加。進一步研究表明上調(diào)miR-101-3p能抑制COX-2的表達;而食管鱗癌細胞中上調(diào)miR-101-3p后發(fā)現(xiàn)COX-2的表達受到抑制。實驗還同時證實了低表達miR-101-3p和高表達的COX-2能抑制腫瘤細胞凋亡、刺激腫瘤細胞生長，導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。同時，還發(fā)現(xiàn)miR-101-3p有抑制食管鱗癌細胞G1期進展能力和抑制細胞增殖的能力。但是，發(fā)現(xiàn)miR-101-3p無抑制癌細胞侵襲和遷移的能力。運用特異性COX-2抑