腺病毒介導D2S基因聯(lián)合溴隱亭治療對人NFPA細胞生長的抑制作用.pdf

1、目的:探討通過腺病毒介導多巴胺2型受體短鏈亞型基因(D2S)感染原代培養(yǎng)的人垂體無功能腺瘤(NFPA)細胞，并聯(lián)合溴隱亭藥物干預對體外培養(yǎng)的NFPA細胞生長活性的影響。
　　 方法:
　　 1、取細胞狀態(tài)良好且處于對于對數(shù)生長期的NFPA細胞，在無血清的培養(yǎng)條件下，應用重組腺病毒載體pAd-D2S-EGFP及pAd-EGFP空載體進行感染，設置未轉(zhuǎn)染組做正常對照，在轉(zhuǎn)染后第12h、24 h、48 h時于激光共聚焦顯微鏡下

2、觀察綠色熒光蛋白表達。
　　 2、將NFPA細胞分為pAd-D2S-EGFP感染組、pAd-EGFP空載體組及正常對照組，分別進行轉(zhuǎn)染及換液處理后，Trizol法提取各組細胞的總RNA，采用RT-PCR方法檢測各組細胞內(nèi)D2S基因的表達變化。
　　 3、取生長狀態(tài)良好的NFPA細胞，并制作爬片，在無血清的培養(yǎng)條件下，應用重組腺病毒載體pAd-D2S-EGFP及pAd-EGFP空載體進行感染，同時設置正常對照組，孵育48h

3、后，用甲醛固定各組細胞并封片，采用免疫熒光染色法，檢測三組細胞D2S蛋白表達情況。
　　 4、應用pAd-D2S-EGFP感染人NFPA細胞，并同步設立pAd-EGFP空載體組及未轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染48h后對各組細胞進行溴隱亭體外藥物干預，相差顯微鏡下觀察并記錄轉(zhuǎn)染前后各組細胞形態(tài)變化。
　　 5、取生長狀態(tài)良好的人NFPA細胞，按上述方法分組，轉(zhuǎn)染48 h后，用溴隱亭藥物干預，CCK-8法檢測干預后12h、24 h、36h、

4、48 h各組細胞活性。
　　 6、應用Hoechst核染色法對藥物干預后的pAd-D2S-EGFP感染組、pAd-EGFP空載體組，及正常對照進行細胞核凋亡的形態(tài)學檢測，激光共聚焦顯微鏡下觀察各組細胞核形態(tài)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1、腺病毒對原代培養(yǎng)的人NFPA細胞具有較高的感染效率，重組腺病毒pAd-D2S-EGFP和pAd-EGFP空載體分別轉(zhuǎn)染NFPA細胞24 h后，激光共聚焦顯微鏡下可觀察到較強的綠

5、色熒光表達。
　　 2、人NFPA細胞轉(zhuǎn)染D2S基因后，檢測到D2S基因的轉(zhuǎn)錄較對照組增高，D2S-EGFP轉(zhuǎn)染組、EGFP-空載體組、正常對照組的2-△△CT值分別為2.14±0.10、1.04±0.07和1.01±0.10，差異有統(tǒng)計學意義。
　　 3、經(jīng)過比較，人NFPA細胞轉(zhuǎn)染D2S基因后，D2S的蛋白表達較其他實驗各組增加，表現(xiàn)為空白對照組無熒光表達，空載體組僅表達綠色熒光蛋白，實驗組同時表達綠色熒光蛋白及紅色

6、熒光蛋白（紅色標記D2S蛋白）。
　　 4、腺病毒轉(zhuǎn)染D2S基因聯(lián)合溴隱亭藥物干預48h后，相差顯微鏡下見細胞山現(xiàn)皺縮脫落、胞內(nèi)空泡等明顯的形態(tài)變化，CCK-8法檢測各組細胞吸光度值發(fā)現(xiàn):pAd-D2S-EGFP轉(zhuǎn)染聯(lián)合溴隱亭治療組的NFPA細胞存活率明顯降低(40.24±5.26)％，空載體加藥組(90.46±9.08)％及單純加藥組(97.00±5.14)％相比，具有明顯差異。
　　 5、腺病毒轉(zhuǎn)染D2S基因聯(lián)合溴隱

7、亭藥物干預48h后，熒光顯微鏡結(jié)合Hoechst核染色觀察到大量凋亡細胞核碎片形成。
　　 結(jié)論:腺病毒可作為垂體腺瘤基因治療研究的載體，其重組腺病毒pAd-D2S-EGFP對原代培養(yǎng)的人NFPA細胞具有較好的親噬性;其攜帶的D2S基因所編碼的D2S蛋白，是溴隱亭等多巴胺受體激動劑類藥物高效的作用位點。通過腺病毒載體向體外培養(yǎng)的NFPA細胞高效導入D2S基因使細胞D2S蛋白表達水平的上凋，可有效地提高人NFPA細胞對溴隱亭治療的