溶瘤腺病毒Ad-VT對熒光素酶標記人肺癌細胞的抑制作用研究.pdf

1、目前，肺癌（LC）是世界上發(fā)病率最高且死亡率最高的一種惡性腫瘤，在全世界范圍內(nèi)其發(fā)病人數(shù)仍呈持續(xù)的上升趨勢。傳統(tǒng)的療法如手術切除、放射治療、化學治療和單抗治療等，僅適合少數(shù)早期患者，雖有一定的治療效果，但難以完全治愈，且副作用大，極易復發(fā)。隨著基因工程在生物和醫(yī)學領域的廣泛應用，使基因靶向療法用于癌癥的治療成為可能?；虔煼ū憩F(xiàn)出越來越突出的優(yōu)勢，尤其以腺病毒為載體靶向癌細胞的療法受到廣泛的關注，將成為研究的熱點，有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)療法用于癌

2、癥的治療。
　　用免疫缺陷動物（如BALB/c裸鼠）建立腫瘤模型是研究溶瘤腺病毒抗腫瘤作用的重要工具，但傳統(tǒng)的動物模型無法連續(xù)地、動態(tài)地研究腫瘤的生長和轉移、以及溶瘤腺病毒的抑瘤作用。熒光素酶基因（luciferase gene）作為常用報告基因之一，具有內(nèi)源性低、穩(wěn)定性好和靈敏度高等特點，廣泛地用于標記各種類型的腫瘤細胞；并建立通過活體成像系統(tǒng)觀察的腫瘤模型，能夠非侵入性地、實時地、連續(xù)地監(jiān)控腫瘤生長和轉移；即使治療過程中腫瘤細

3、胞的細微變化也能及時地檢測到，為進一步在整體水平上研究溶瘤腺病毒的抑瘤效果提供了理想的動物模型。
　　本課題組構建的重組腺病毒（Ad-VT、Ad-T、Ad-VP3和Ad-Mock）采用的是RAPAd.I包裝系統(tǒng)， Ad-VT（Ad-Apoptin-hTERTp-E1A）是由腫瘤特異性啟動子（hTERTp，人端粒酶逆轉錄酶）啟動E1 A基因（病毒復制必需基因）、巨細胞病毒（CMV）啟動子啟動凋亡素基因（Apoptin），因此Ad-V

4、T既具有腫瘤特異性殺傷和腫瘤特異性復制能力的雙特異性溶瘤腺病毒；對照病毒Ad-T（Ad-hTERTp-E1A）、Ad-VP3（Ad-CMV-Apoptin）和Ad-Mock。
　　研究目的：本研究通過建立熒光素酶標記人肺癌細胞 A549-luc和 BALB/c裸鼠皮下荷瘤模型，來探討溶瘤腺病毒Ad-VT對A549-luc細胞的抑制作用。
　　研究內(nèi)容：
　　1.篩選穩(wěn)定表達熒光素酶人肺癌細胞 A549-luc，并進行了

5、熒光素酶活性及穩(wěn)定性、體外成像和生物學特性的檢測；
　　2.溶瘤腺病毒Ad-VT對熒光素酶標記人肺癌細胞的體外抑制作用研究；3.溶瘤腺病毒Ad-VT對熒光素酶標記人肺癌細胞的體內(nèi)抑制作用研究。
　　研究方法：
　　1.熒光素酶標記人肺癌細胞的構建與鑒定:通過質(zhì)粒轉染與G418加壓篩選、熒光素酶活性及穩(wěn)定性和體外成像等方法篩選出穩(wěn)定表達熒光素酶的人肺癌細胞，并進行了A549-luc細胞和A549細胞的生長特性、遷移和侵襲

6、能力及細胞周期等生物學特性的檢測。
　　2.溶瘤腺病毒Ad-VT對熒光素酶標記人肺癌細胞的體外抑制作用研究:通過結晶紫染色和WST-1研究Ad-VT對A549-luc細胞和A549細胞的殺傷作用，并從線粒體膜電位(JC-1染色）、細胞核(Hoec hst染色）和細胞膜（AnnexinV-FITC/PI染色）等的形態(tài)學變化驗證Ad-VT對A549-luc細胞和A549細胞的殺傷途徑，再通過劃痕實驗、Transwell小室遷移和Bio

7、Coat小室侵襲等研究Ad-VT對A549-luc細胞和A549細胞的遷移和侵襲能力影響。
　　3.溶瘤腺病毒Ad-VT對熒光素酶標記人肺癌細胞的體內(nèi)抑制作用研究:通過對BALB/c裸鼠的右后肢近背部區(qū)域皮下接種 A549-luc細胞，成功建立皮下荷瘤模型后，隨機分成六組；從0W開始，用活體成像系統(tǒng)每周拍照一次，并用游標卡尺測量腫瘤大小，連續(xù)測定6W～7W；2W后用重組腺病毒開始治療，連續(xù)治療4W，研究溶瘤腺病毒Ad-VT對腫瘤的

8、抑制效果和小鼠生存期的影響。
　　研究結果：
　　1.通過質(zhì)粒轉染與G418加壓篩選、熒光素酶活性及穩(wěn)定性檢測，獲得一株活性最高且穩(wěn)定性最好的C lo ne28；通過體外成像實驗，驗證了C lo ne28的細胞數(shù)目與其發(fā)光強度呈正相關的線性關系，R2=0.9948；通過A549-luc細胞和A549細胞生物學特性鑒定，證明了構建過程對細胞的生長特性、遷移和侵襲能力以及細胞周期未產(chǎn)生顯著的影響。
　　2.通過結晶紫染色和

9、WST-1檢測，證實了Ad-VT對A549-luc細胞和A549細胞的殺傷作用無顯著差異，且具有顯著時間效應和劑量效應，而重組腺病毒對細胞抑制率依次為：Ad-VT＞Ad-T＞Ad-VP3＞Ad-Mock；通過JC-1染色、Hoechst染色和Annexin V-FITC/PI染色實驗，表明Ad-VT對A549-luc細胞和A549細胞的殺傷途徑無顯著差異，且Ad-VT主要通過誘導凋亡（如線粒體膜電位的變化、核碎裂、核濃染和磷酯酰絲氨酸翻

10、轉等典型形態(tài)學特征）發(fā)揮殺傷作用，而重組腺病毒誘導凋亡的能力依次為：Ad-VT＞Ad-T＞Ad-VP3＞Ad-Mock；通過劃痕實驗、Transwell小室遷移和BioCoat小室侵襲，表明Ad-VT對A549-luc細胞和A549細胞的遷移和侵襲能力影響無顯著差異，且具有顯著時間效應和劑量效應，而重組腺病毒抑制遷移和侵襲能力依次為：Ad-VT＞Ad-T＞Ad-VP3＞Ad-Mock。
　　3.通過對BALB/c裸鼠右后肢近背部皮

11、下接種A549-luc細胞后，成功地建立了裸鼠皮下荷瘤模型；0W～3W時，Ad-VT治療組腫瘤的平均生物發(fā)光強度、平均腫瘤體積與其他治療組無明顯差異；3W～5W時，Ad-VT治療組的平均生物發(fā)光強度、平均腫瘤生長速度與對照組相比，顯著降低，而平均腫瘤抑制率顯著增大；腫瘤體積與其生物發(fā)光強度之間呈一定的正相關的線性關系，生物發(fā)光強度隨著腫瘤體積的增加而增強；Ad-VT治療組小鼠的平均生存期顯著延長。
　　研究結論：
　　1.成

12、功構建了穩(wěn)定表達熒光素酶的人肺癌細胞A549-luc，并驗證了A549-luc細胞和A549細胞的生物學特性無顯著差異。
　　2.溶瘤腺病毒Ad-VT對熒光素酶標記人肺癌細胞A549-luc具有顯著殺傷作用，主要通過誘導細胞凋亡發(fā)揮殺傷作用，并能有效減弱 A549-luc細胞的遷移和侵襲能力。
　　3.成功建立了BALB/c裸鼠皮下荷瘤模型，借助活體成像系統(tǒng)能夠在活體內(nèi)實時地監(jiān)控腫瘤生物發(fā)光強度和體積變化；溶瘤腺病毒 Ad-