棉花PPR基因分析及VIGS功能驗(yàn)證.pdf

1、細(xì)胞質(zhì)雄性不育在高等植物中廣泛存在，受到育性恢復(fù)基因的抑制或互作。目前已克隆的育性恢復(fù)基因多屬于 PPR基因。本實(shí)驗(yàn)室前期對哈克尼西棉細(xì)胞質(zhì)雄性不育育性恢復(fù)基因 Rf1的研究發(fā)現(xiàn)其位于雷蒙德氏棉 D5基因組第9號染色體上。本研究分析了亞洲棉、雷蒙德氏棉和陸地棉基因組上的PPR基因，并對D5基因組第9號染色體上的PPR基因進(jìn)行VIGS功能驗(yàn)證。對D5基因組第9號染色體上的89條PPR基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，將其分為9類，依次命名為L1-L9。

2、每一類選取同源性較高的區(qū)段作為插入片段，連接至pCLCrVA載體上，構(gòu)建為重組病毒載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法接種F1植株，后期進(jìn)行表型觀察及轉(zhuǎn)錄分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果主要為：
　　1.預(yù)測A2、D5和AD1基因組分別包含586條、589條和1133條PPR基因，成簇分布于染色體上。推測亞洲棉與雷蒙德氏棉在經(jīng)花粉融合及加倍形成陸地棉的過程中，或是長期的持續(xù)進(jìn)化過程中，丟失了42條PPR基因。
　　2. VIGS技術(shù)沉默D5基因組第9號染色體上

3、的89條PPR基因，其中66條基因表現(xiàn)為下調(diào)，23條基因表現(xiàn)為未下調(diào)。L1含有32條基因，其中的27條基因表達(dá)量下調(diào)。L6含有27條基因，只有14條基因表達(dá)量下調(diào)。表明 VIGS技術(shù)沉默基因家族的多個(gè)成員時(shí)，基因之間的沉默效率不一致，選取合適的插入片段對于沉默效率具有重要的影響。
　　3.育性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，L1、L2和 L6出現(xiàn)了單朵花的不育，同時(shí)出現(xiàn)半不育性狀。相對熒光定量結(jié)果顯示VIGS技術(shù)僅僅能夠部分沉默而不是完全沉默功能基因，

4、陽性株所表現(xiàn)出來的育性不一致或不穩(wěn)定，同時(shí)也表明PPR基因可能與植株育性有關(guān)。
　　4. L1陽性株表現(xiàn)為黃綠突變，葉片邊緣內(nèi)卷或外卷，并在后期恢復(fù)。L3和L9陽性株呈現(xiàn)白化突變，呈斑狀，最初出現(xiàn)在葉脈附近，之后延至整個(gè)葉片，可維持至生育后期。石蠟切片顯微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，對照植株葉片的海綿組織不規(guī)則，細(xì)胞間隙較大，而 L3和 L9葉片柵欄組織細(xì)胞較短，海綿組織細(xì)胞間隙較小，海綿組織較規(guī)則。利用 VIGS技術(shù)對 L3和 L9的單個(gè)基因

5、進(jìn)行VIGS沉默，發(fā)現(xiàn)L3-1、L9-5和L9-6陽性株分別表現(xiàn)為葉色突變，表明這3條基因可能參與葉綠素合成及代謝等過程。
　　5.手扯法測定棉纖維長度，與對照植株相比，L1、L3和 L6陽性株的棉纖維長度呈顯著性降低，L7陽性株的棉纖維長度呈現(xiàn)為極顯著的增長。表明 PPR基因可能與棉纖維的發(fā)育和伸長有關(guān)。利用psRNA Target預(yù)測miRNA靶位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)L1中有25條基因?yàn)閙iR7505的靶基因，表明miR7505可能與纖維