精子中孕酮受體和環(huán)磷酸腺苷應(yīng)答元件調(diào)節(jié)器的mRNA的研究.pdf

1、　　目的：觀察精子中是否存在孕酮受體(PR)和環(huán)磷酸腺苷應(yīng)答元件調(diào)節(jié)器(CREM)的mRNA，同時觀察精子中的mRNA水平與精子活力和形態(tài)是否相關(guān)?！　》椒ǎ喝?個正常人的精液，分別采用上游法和Percoll(40％/80％)分離精子，取出上游出來的精子和80％層的精子，在顯微鏡下觀察，初步確定沒有別的細胞污染后，提取精子中的RNA。由于精子中可能污染白細胞、睪丸未成熟生殖細胞和脫落上皮細胞，本實驗采用RT-PCR的方法，對上述細胞特

2、異表達的基因進行擴增：利用CD45基因檢測白細胞污染、c-kit基因檢測未成熟生殖細胞污染，E-cadherin基因檢測上皮細胞污染；實驗過程中同時設(shè)立陽性陰性對照。在確認分離的精子中沒有上述細胞污染后再進行目的基因進行擴增。為了進一步確認RNA提取成功與否，本實驗還對精子特異表達的魚精蛋白基因(P2)進行擴增，P2基因的引物設(shè)計是跨外顯子的，所以P2的擴增還可以排除RNA中的DNA的污染。在確保精子中無別的細胞污染，提取的RNA中無D

3、NA污染的前提下，對PR和CREM進行擴增，并以GAPDS基因作為參照基因，對PR和CREM基因的mRNA水平進行半定量分析：采用ImageMaster2DElite軟件分析PCR電泳條帶吸光度容積，計算目的基因RT-PCR產(chǎn)物吸光度容積與GAPDS吸光度容積的比值，作為目的基因mRNA的相對含量，比較兩種分離方法得到的精子中的兩個基因的mRNA水平是否有差異。結(jié)果采用SPSS軟件進行配對t檢驗?！　〗Y(jié)論：本實驗是首次證實了精子中存在