精子中孕酮受體和環(huán)磷酸腺苷應(yīng)答元件調(diào)節(jié)器的mRNA的研究.pdf

1、　　目的：觀察精子中是否存在孕酮受體(PR)和環(huán)磷酸腺苷應(yīng)答元件調(diào)節(jié)器(CREM)的mRNA，同時(shí)觀察精子中的mRNA水平與精子活力和形態(tài)是否相關(guān)。　　方法：取9個(gè)正常人的精液，分別采用上游法和Percoll(40％/80％)分離精子，取出上游出來的精子和80％層的精子，在顯微鏡下觀察，初步確定沒有別的細(xì)胞污染后，提取精子中的RNA。由于精子中可能污染白細(xì)胞、睪丸未成熟生殖細(xì)胞和脫落上皮細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR的方法，對(duì)上述細(xì)胞特

2、異表達(dá)的基因進(jìn)行擴(kuò)增：利用CD45基因檢測白細(xì)胞污染、c-kit基因檢測未成熟生殖細(xì)胞污染，E-cadherin基因檢測上皮細(xì)胞污染；實(shí)驗(yàn)過程中同時(shí)設(shè)立陽性陰性對(duì)照。在確認(rèn)分離的精子中沒有上述細(xì)胞污染后再進(jìn)行目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。為了進(jìn)一步確認(rèn)RNA提取成功與否，本實(shí)驗(yàn)還對(duì)精子特異表達(dá)的魚精蛋白基因(P2)進(jìn)行擴(kuò)增，P2基因的引物設(shè)計(jì)是跨外顯子的，所以P2的擴(kuò)增還可以排除RNA中的DNA的污染。在確保精子中無別的細(xì)胞污染，提取的RNA中無D

3、NA污染的前提下，對(duì)PR和CREM進(jìn)行擴(kuò)增，并以GAPDS基因作為參照基因，對(duì)PR和CREM基因的mRNA水平進(jìn)行半定量分析：采用ImageMaster2DElite軟件分析PCR電泳條帶吸光度容積，計(jì)算目的基因RT-PCR產(chǎn)物吸光度容積與GAPDS吸光度容積的比值，作為目的基因mRNA的相對(duì)含量，比較兩種分離方法得到的精子中的兩個(gè)基因的mRNA水平是否有差異。結(jié)果采用SPSS軟件進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)?！　〗Y(jié)論：本實(shí)驗(yàn)是首次證實(shí)了精子中存在