環(huán)磷酸腺苷受體等蛋白的構(gòu)象變化機(jī)理研究.pdf

1、很多蛋白通過(guò)構(gòu)象變化而工作，本論文選擇環(huán)磷酸腺苷受體蛋白(cAM Preceptor protein,CRP)和丙酮酸激酶(Pyruvte kinase，PK)作為研究對(duì)象，應(yīng)用多種技術(shù)手段研究其構(gòu)象變化機(jī)理。
　　環(huán)磷酸腺苷受體蛋白(cAMP receptor protein，CRP)，也稱(chēng)為分解代謝基因活化蛋白(catabolite gene activator protein，CAP)，是原核生物中一個(gè)典型的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白。C

2、RP是由兩個(gè)相同亞基組成的二聚體，每個(gè)亞基中包含兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域:較大的N-端結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)結(jié)合環(huán)磷酸腺苷(cAMP)分子，而較小的C-端結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)識(shí)別特異的DNA序列。CRP與cAMP結(jié)合后，其構(gòu)象發(fā)生變化并與特定序列的DNA結(jié)合，該DNA與RNA聚合酶結(jié)合后啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程。CRP已經(jīng)成為構(gòu)象變化研究中的一個(gè)模型蛋白。目前，apo-CRP、CRP-cAMP復(fù)合物、CRP-cAMP-DNA復(fù)合物、CRP-cAMP-DNA-RNAP復(fù)合

3、物晶體結(jié)構(gòu)均已獲得。在apo-CRP中，識(shí)別DNA的F-螺旋被包埋在內(nèi)部;當(dāng)CPP與cAMP結(jié)合后，F(xiàn)-螺旋伸展，進(jìn)而識(shí)別特定序列的DNA。盡管人們對(duì)該蛋白進(jìn)行了大量的研究，對(duì)其工作機(jī)理也有了較深入的認(rèn)識(shí)，但仍有諸多問(wèn)題等待解決，如apo-CRP、CRP-cAMP2、CRP-cAMP3和CRP-cAMP4的結(jié)構(gòu)已知，但CRP-cAMP1的結(jié)構(gòu)仍未知，而apo-CRP和CRP-cAMP2構(gòu)象之間發(fā)生了很大的構(gòu)象變化，這使CRP-cAMP1

4、相關(guān)的結(jié)構(gòu)研究變得尤為重要。
　　丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase，PK)是糖酵解中的一個(gè)關(guān)鍵酶，在活化離子存在的條件下，PK催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)轉(zhuǎn)變?yōu)楸?pyruvate)。PK是由四個(gè)相同的亞基組成的同源四聚體，這四個(gè)亞基之間形成了兩個(gè)近似相互垂直的界面:Y-界面和Z-界面。每個(gè)亞基包含四個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域:N-端結(jié)構(gòu)域、結(jié)構(gòu)域A、B、C。每個(gè)亞基還包含三個(gè)色氨酸:Trp-157、Trp-481和Trp-5

5、14，其中Trp-157位于活性口袋中，與Z-界面接近;而Trp-481和Trp-514位于C結(jié)構(gòu)域中，靠近Y-界面。因此，這些色氨酸可以作為良好的熒光探針來(lái)研究丙酮酸激酶在活化離子、底物和抑制劑等不同配體誘導(dǎo)下的構(gòu)象變化機(jī)理。PK的B結(jié)構(gòu)域具有很強(qiáng)的動(dòng)態(tài)性，通過(guò)B結(jié)構(gòu)域的旋轉(zhuǎn)可以使得B結(jié)構(gòu)域和A結(jié)構(gòu)域之間的活性口袋分別處于“張開(kāi)”和“關(guān)閉”的構(gòu)象，“張開(kāi)”的構(gòu)象代表PK處于活性狀態(tài)，而“關(guān)閉”的構(gòu)象則代表PK處于非活性狀態(tài)。雖然基于這

6、兩個(gè)狀態(tài)的模型可以很好的描述丙酮酸激酶的變構(gòu)調(diào)控行為，然而，PK具體的催化變構(gòu)機(jī)理仍不明確。
　　針對(duì)以上環(huán)磷酸腺苷受體等蛋白在構(gòu)象變化機(jī)理研究方面的問(wèn)題，本學(xué)位論文分為五個(gè)章節(jié)開(kāi)展研究工作。各章節(jié)主要內(nèi)容如下:
　　第一章是緒論。首先對(duì)環(huán)磷酸腺苷受體蛋白和丙酮酸激酶的研究概況和發(fā)展前景進(jìn)行了簡(jiǎn)述，并在此基礎(chǔ)上引出了本文的研究方向，即采用結(jié)晶學(xué)、光譜學(xué)、生物物理等技術(shù)手段來(lái)研究這兩種重要功能蛋白的構(gòu)象變化機(jī)理。
　　第

7、二章主要介紹CRP蛋白cAMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域的表達(dá)、純化、結(jié)晶和晶體結(jié)構(gòu)解析。本論文選擇兩種特別的蛋白水解酶（枯草桿菌蛋白酶和糜蛋白酶）對(duì)CRP進(jìn)行酶切，得到兩種CRP的cAMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域:S-CRP（氨基酸殘基1-133）和CH-CRP(氨基酸殘基1-137)。本文采用了特殊的結(jié)晶方法得到了S-CRP-cAMP和CH-CRP-cAMP復(fù)合體的單晶，并對(duì)其晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，其分辨率分別為2.0(A)和2.8(A)。本文著重介紹了S-CRP

8、-cAMP復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu):每個(gè)不對(duì)稱(chēng)的晶胞中包含四個(gè)二聚體，它們整體的折疊情況和二聚化方式與全長(zhǎng)的CRP分子相似，根據(jù)它們結(jié)合cAMP的數(shù)量和位置的不同，這四個(gè)二聚體可以分為三種類(lèi)型:S-CRP-cAMP2、S-CRP-cAMP1和S-CRP-cAMP2。其中，S-CRP-cAMP1和S-CRP-cAMP2，都是第一次獲得，研究表明一個(gè)cAMP分子也可以使得C-helices（殘基112-133）得到重排和穩(wěn)定化。
　　第三章主

9、要介紹CRP蛋白cAMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化和動(dòng)態(tài)性研究。本論文采用了傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）技術(shù)來(lái)研究S-CRP和CH-CRP在結(jié)合cAMP前后的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成以及動(dòng)態(tài)性變化。從而明確CRP鉸鏈區(qū)(殘基134-138)以及l(fā)oop3（殘基53-57）和Phe136的相互作用在cAMP誘導(dǎo)的CRP構(gòu)象變化和信號(hào)傳導(dǎo)中的作用。研究表明，cAMP誘導(dǎo)的CRP活化包含顯著的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化:C-helix含量的增加和β strand4或者β

10、 strand5含量的減小，即結(jié)合cAMP增加了CRP蛋白cAMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性。同時(shí)，結(jié)合cAMP所引起的C-helix的增加使得S-CRP-cAMP和CH-CRP-cAMP的動(dòng)態(tài)性都有所減小。鉸鏈區(qū)的存在使得CH-CRP比S-CRP更具動(dòng)態(tài)性，但是，loop3和CRP鉸鏈區(qū)的相互作用沒(méi)有參與構(gòu)象變化過(guò)程中的信號(hào)傳導(dǎo)。
　　第四章最主要介紹了不同配體誘導(dǎo)下的丙酮酸激酶構(gòu)象變化機(jī)理的研究。本論文分別對(duì)PK的三個(gè)色氨酸殘基進(jìn)行了

11、定點(diǎn)突變，并通過(guò)熒光淬滅、圓二光譜(CD)和傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)等技術(shù)分別對(duì)野生態(tài)和突變體PK進(jìn)行了研究。定點(diǎn)突變沒(méi)有改變PK的二級(jí)結(jié)構(gòu)，同時(shí)，由活化離子和底物誘導(dǎo)產(chǎn)生的熒光信號(hào)的變化主要來(lái)源于Trp-157，Phe的結(jié)合使得Trp-481和Trp-514處于一個(gè)更加親水環(huán)境中。本章重點(diǎn)討論了B結(jié)構(gòu)域的運(yùn)動(dòng)在PK催化反應(yīng)中的作用，即活化離子所誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)域B的旋轉(zhuǎn)使得PK活性口袋“張開(kāi)”，而底物的結(jié)合所引起的結(jié)構(gòu)域B的旋轉(zhuǎn)又使得

12、PK活性口袋“閉合”，從而使得PK的催化反應(yīng)得以進(jìn)行。
　　第五章主要介紹丙酮酸激酶催化變構(gòu)機(jī)理的熱動(dòng)力學(xué)研究。本論文使用等溫量熱滴定(ITC)技術(shù)，首次得到了PK催化底物反應(yīng)過(guò)程中的熱動(dòng)力學(xué)常數(shù)，明確了不同活化離子（鉀離子和鎂離子）和抑制劑（苯丙氨酸）在PK構(gòu)象變化中的作用。活化離子濃度的增加使得反應(yīng)體系中的活性狀態(tài)的百分比含量逐漸增加，而增加抑制劑的濃度則會(huì)起到相反的作用。另外，我們提出了鉀離子和鎂離子誘導(dǎo)PK構(gòu)象變化的機(jī)理，