鎘致肺纖維化作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、背景：
　　鎘是一種蓄積性毒物，一般情況下鎘在地球表面低濃度存在，但是自然界中存在的鎘很難被降解，隨著工業(yè)污染的加重在環(huán)境中聚集。人類的鎘暴露途徑主要是通過職業(yè)接觸或通過消化道食入鎘污染的食物或水，鎘在人體內(nèi)的半衰期長(zhǎng)達(dá)16-30年，是對(duì)人類和其它動(dòng)物各臟器均有損害，且具有致癌性，早在1987年，國(guó)際癌癥研究協(xié)會(huì)(IARC)把鎘定為ⅡA級(jí)具有致癌性的物質(zhì)，又在1993年，鎘被修訂為ⅠA級(jí)具有致癌性的物質(zhì)，即對(duì)人類具有致癌性的物質(zhì)。

2、國(guó)際勞動(dòng)衛(wèi)生重金屬委員會(huì)和聯(lián)合國(guó)環(huán)境規(guī)劃署(DNFP)把鎘列為第6位對(duì)人體健康有嚴(yán)重危害的環(huán)境中的有毒物質(zhì)，其危害性僅次于黃曲霉素和砷。鎘被廣泛用于電鍍、油漆、顏料、電池、照相材料等工業(yè)，隨著工業(yè)的發(fā)展，含鎘的毒性物質(zhì)只會(huì)越來越多，鎘對(duì)人類健康損害及環(huán)境所造成的破壞日益嚴(yán)重。鎘被美國(guó)農(nóng)業(yè)委員會(huì)列為目前農(nóng)業(yè)環(huán)境污染物中最重要的一種。鎘引起的環(huán)境污染也受到世界各國(guó)高度重視。除外職業(yè)性鎘接觸及飲用或食入鎘污染的水源和動(dòng)植物導(dǎo)致鎘在體內(nèi)蓄積外，

3、吸煙是人體接觸鎘并引起鎘在體內(nèi)蓄積的主要途徑。鎘對(duì)人體損害的研究目前多集中于鎘致腎損害的研究，鎘對(duì)肺部損害的研究報(bào)道較少，我們?cè)趯?duì)鎘中毒患者死亡后尸體解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)死者肺組織廣泛纖維化，在我們的實(shí)驗(yàn)中將通過前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證鎘是否可以導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺纖維化。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究鎘引起肺纖維化的分子機(jī)制。肺纖維化是多種病因引起的以肺間質(zhì)進(jìn)行性纖維化，呼吸功能逐漸下降為主要表現(xiàn)的一組肺間質(zhì)性疾病，對(duì)人體危害嚴(yán)重，從確診肺纖維化后

4、患者生存時(shí)間為2-5年，5年存活率僅為20％，且到目前為止無有效的防治措施，相關(guān)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)隨著工業(yè)對(duì)環(huán)境污染的加劇肺纖維化發(fā)病率逐年增高。國(guó)內(nèi)外研究者期望通過對(duì)肺纖維化機(jī)制的研究入手，找到治療肺纖維化的新方法。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)新的研究方法和技術(shù)的不斷更新，近年來對(duì)肺纖維化機(jī)制的研究也不斷深入，但是肺纖維化發(fā)生機(jī)制比較復(fù)雜、影響因素又多，目前仍然沒有突破性進(jìn)展。已有研究發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)與肺纖維化成纖維細(xì)胞聚集密切相關(guān)，EM

5、T是一個(gè)復(fù)雜的階梯式過程，主要特征是細(xì)胞失去上皮細(xì)胞極性和上皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記物E-鈣粘素(E-cadhering，E-cad)，以及獲得間質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和波紋蛋白(Vimentin)等，且細(xì)胞形態(tài)由立方形變成梭形。EMT轉(zhuǎn)分化方式可能與多條信號(hào)通路有關(guān)，上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(EGFR)主要位于上皮細(xì)胞質(zhì)膜上，很多研究表明上皮生長(zhǎng)因子受體與肺纖維化過程中成纖維細(xì)胞和肌成纖維母細(xì)胞過度活化及增殖有關(guān)。氣

6、管及支氣管上皮細(xì)胞及臨近的間充質(zhì)細(xì)胞在刺激物作用下可產(chǎn)生上皮生長(zhǎng)因子，與上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞膜上的EGFR結(jié)合，可導(dǎo)致上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化。
　　目的：
　　對(duì)鎘引起肺纖維化分子機(jī)制的初步研究，為臨床預(yù)防、治療鎘引起的肺纖維化及鎘引起其它人體損害的治療提供新的思路和治療靶點(diǎn)，也有助其它原因引起的肺纖維化治療。
　　方法：
　　1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):經(jīng)呼吸道吸入及腹腔注射兩種途徑，給予實(shí)驗(yàn)大鼠高、中、

7、低劑量的鎘;經(jīng)68天后將未死亡大鼠統(tǒng)一斷頸處死并行尸體解剖（提前死亡的大鼠，即時(shí)進(jìn)行解剖），記錄大體解剖情況，及肺組織HE染色觀察鎘引起肺部損傷的形態(tài)學(xué)改變;取部分組織凍存?zhèn)溆谩?br>　　2.通過對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肺組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀察肺組織中上皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物E-cadherin及間質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物α-SMA的定位及表達(dá)情況。
　　3.體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn):體外培養(yǎng)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(A549)，用10mM/LCdCl2處理生

8、長(zhǎng)良好的體外培養(yǎng)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，于24h、48h、72h觀察處理后的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　4.熒光定量PCR檢測(cè)a-SMA mRNA和E-cad mRNA的表達(dá)情況:通過熒光定量PCR檢測(cè)隨鎘處理時(shí)間的延長(zhǎng)時(shí)a-SMA mRNA和E-cad mRNA在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　5.Western blot檢測(cè)a-SMA、E-cad蛋白:Western blot檢測(cè)隨鎘處理時(shí)間的延長(zhǎng)時(shí)a-SMA、E-

9、cad在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中表達(dá)的變化。
　　6.Western blot檢測(cè)磷酸化的EGFR(p-EGFR)表達(dá)情況，p-EGFR代表EGFR受體途徑激活。
　　結(jié)果：
　　1.對(duì)呼吸道霧化吸入及腹腔注射不同劑量的鎘的實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行大體解剖發(fā)現(xiàn)均可引起不同程度的肺部損傷——肺部炎癥、肺淤血、肺水腫伴肺間質(zhì)纖維組織增生，其中經(jīng)呼吸道吸入組肺部炎癥及纖維組織增生比腹腔注射組嚴(yán)重。
　　2.免疫組織化學(xué)染色觀察到，間質(zhì)細(xì)

10、胞特異性標(biāo)記物α-SMA在鎘注射組及吸入組大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá);上皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物E-cad在鎘注射組及吸入組大鼠肺間質(zhì)部分成纖維細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)（此部分成纖維細(xì)胞可能來源于發(fā)生了EMT的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞）。
　　3.倒置相差顯微鏡觀察用10mM/LCdCl2處理生長(zhǎng)良好的體外培養(yǎng)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，于24h、48h、72h觀察處理后的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞由原來的扁平多邊形變?yōu)樗笮?，形態(tài)如同纖維細(xì)胞，而且細(xì)胞

11、間隙變大，細(xì)胞間離散。
　　4.熒光定量檢測(cè)a-SMA mRNA和E-cad mRNA的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn):隨鎘處理時(shí)間的延長(zhǎng)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記a-SMA mRNA表達(dá)上調(diào)，并隨鎘處理時(shí)間的延長(zhǎng)而表達(dá)量呈增加趨勢(shì)，而上皮細(xì)胞標(biāo)記E-cad mRNA在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)。
　　5.Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨鎘處理時(shí)間的延長(zhǎng)體外培養(yǎng)的大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物a-SMA的表達(dá)增加，上皮細(xì)胞標(biāo)記

12、物E-cad表達(dá)減少。
　　6.Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨鎘處理時(shí)間的延長(zhǎng)體外培養(yǎng)的大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR及其活化形式p-EGFR蛋白表達(dá)增加。
　　結(jié)論：
　　1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及鎘中毒死亡案例鏡下改變結(jié)果均證實(shí)經(jīng)呼吸道吸入和腹腔注射CdCl2均可導(dǎo)致肺纖維化，其中呼吸道吸入組肺部炎癥及纖維組織增生程度較腹腔注射組嚴(yán)重。
　　2.體內(nèi)鎘誘導(dǎo)的肺炎性損傷及纖維組織增生，肺組織中發(fā)現(xiàn)了肺泡Ⅱ