細(xì)菌脂多糖及激素對(duì)角膜Toll樣受體表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過(guò)研究細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)對(duì)人角膜上皮細(xì)胞系(hunmancornealepithelialcellline，HCEC)和角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞(hunmancornealfibroblasts，HCF)Toll樣受體(toll-likereceptors，TLRs)的表達(dá)和功能的影響，以及糖皮質(zhì)激素對(duì)這種影響的調(diào)控，探討TLRs及糖皮質(zhì)激素在角膜細(xì)菌感染中的可能作用。 方法：首先通過(guò)R

2、T-PCR.及quantitativeReal-TimePCR檢測(cè)HCEC和HCF中TLRs在mRNA水平的表達(dá)；然后在兩種細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入三種濃度的LPS(1，10，100ng/ml)共培養(yǎng)48小時(shí)，通過(guò)Real-TimePCR檢測(cè)此時(shí)兩種細(xì)胞TLRs的表達(dá)；以及在此基礎(chǔ)上，選擇在10ng/mlLPS刺激的兩種細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入三種濃度的氫化可的松(1，10，100μg/ml)進(jìn)行干預(yù)，并檢測(cè)此種情況下兩種細(xì)胞ILRs的表達(dá)。再用酶

3、聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbentassays，ELISA)來(lái)檢測(cè)以上三種情況下兩種細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-8的釋放。并且通過(guò)免疫熒光組化來(lái)檢測(cè)TLR2、TLR4在蛋白水平的表達(dá)。 結(jié)果：TLRL-10mRNA在HCEC和HCF均有表達(dá)，且表達(dá)量各不相同。LPS能增加兩種細(xì)胞TLRsmRNA的表達(dá)，以TLR2、4mRNA增加最明顯，且當(dāng)LPS為10ng/ml時(shí)TLRs的表達(dá)量最高，同時(shí)IL-

4、6、IL-8的釋放也相應(yīng)增高。在10ng/mlLPS刺激的HCEC和HCF培養(yǎng)液中加入不同濃度的氫化可的松干預(yù)后，隨著激素濃度的增加，HCEC中ILRsmRNA的表達(dá)也隨之增加，此時(shí)IL-6的釋放減少，IL-8的釋放增加；但HCF中TLRsmRNA的表達(dá)卻隨激素濃度的增高而下降，并且此時(shí)IL-6和IL-8的釋放均下降。免疫熒光組化也顯示了三種情況下HCEC和HCF的TLR2、TLR4在胞內(nèi)均有表達(dá)，且強(qiáng)度不同，趨勢(shì)與分子水平的表達(dá)一致。

5、 結(jié)論：TLR1-10mRNA在HCEC和HCF均有表達(dá)，不同的TLRs在同一細(xì)胞的表達(dá)量不同，而同一TLR在兩種不同細(xì)胞的表達(dá)量也不同。LPS能改變兩種細(xì)胞TLRsmRNA的表達(dá)，提示兩種細(xì)胞表達(dá)的TLRs與角膜抵御細(xì)菌的固有免疫密切相關(guān)；糖皮質(zhì)激素可以調(diào)控LPS刺激的HCEC和HCFILRs的表達(dá)，即對(duì)LPS刺激的HCECTLRs的表達(dá)表現(xiàn)輕度促進(jìn)，而對(duì)LPS刺激的HCFTLRs的表達(dá)表現(xiàn)出抑制；提示在細(xì)菌侵襲角膜的早期，糖