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文檔簡介
1、第一部分、TOLL樣受體4在脂多糖誘導的小鼠急性腎功能衰竭中的表達及意義
論文1:TLR4與小鼠內毒素型急性腎功能衰竭的相關性研究
目的:研究TOLL樣受體4(TOLL like receptor 4,TLR4)與內毒素誘導的小鼠急性腎功能衰竭(ARF)的相關性關系。
方法:建立脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)15mg/kg單次腹腔注射誘導雄性C57BL/6小鼠內毒素性急性
2、腎功能衰竭模型。分別于注射后第12h、24h、36h、48h的時間點采集血液及組織標本。檢測血肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)及用Nomura評分法對腎組織病理改變進行半定量評分。應用免疫組織化學SABC法對正常對照組(NG)及急性腎功能衰竭(ARF)組小鼠腎組織標本中的TLR4進行定位及半定量分析;Western blot檢測兩組腎組織總TLR4蛋白的改變;RT-PCR檢測各組小鼠腎組織總TLR4 mRNA的表達變化。TUNEL法檢測兩
3、組腎組織中凋亡小體情況。
結果:注射LPS后模型組BUN、Cr逐漸上升,24h達高峰(BUN 28.14±2.55mmol/L,Cr 207.73±12.1μmol/L),約48h后逐漸恢復正常;與NG組相比,ARF組的TLR4蛋白及mRNA水平的表達顯著上調,以造模24h時最明顯;TUNEL法結果顯示凋亡小體主要出現(xiàn)在ARF組腎臟的近端小管及管周圍,腎小球無明顯變化。TLR4蛋白的光密度值與Cr、BUN值的相關系數(shù)分別為
4、0.907、0.926;與腎組織凋亡的光密度值的相關系數(shù)為0.954;腎組織凋亡的光密度值與Cr、BUN值的相關系數(shù)分別為0.932、0.951。
結論:TLR4、腎組織凋亡均與小鼠內毒素型ARF的腎功能改變呈正相關關系,同時TLR4與腎組織凋亡也呈正相關關系,TLR4可能通過促進腎組織細胞凋亡參與ARF的發(fā)生。
論文2:應用基因缺失小鼠研究TOLL樣受體4在脂多糖誘導的急性腎功能衰竭中的作用
5、目的:進一步明確TOLL樣受體4(TLR4)在脂多糖(LPS)誘導的小鼠急性腎功能衰竭(ARF)腎臟中的作用機制。
方法:以TLR4基因缺失的C3H/HeJ小鼠和其野生正常對照的C3H/HeN小鼠為實驗對象。實驗分TLR4+(C3H/HeN)組、TLR4-(C3H/HeJ)組小鼠,單次性腹腔注射LPS(15mg/kg)誘導小鼠ARF模型。24h后檢測血清肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)值來評估腎功能;Nomura評分法對腎組
6、織病理改變進行半定量評分;免疫組織化學SABC法檢測TLR4在兩組小鼠腎組織中的表達、RT-PCR法檢測腎組織總TLR4 mRNA的表達變化、免疫蛋白印跡檢測腎組織總TLR4蛋白水平;TUNEL法檢測腎臟組織的凋亡情況。
結果:TLR4+(C3H/HeN)組的Cr、BUN分別為202.26±11.08umol/L、20.36±1.52mmol/L,TLR4-(C3H/HeJ)組的Cr、BUN分別為109.67±13.32u
7、mol/L、6.42±0.41mmol/L,差異有顯著性(P<0.01);TLR4-(C3H/HeJ)組的腎組織結構正常,無明顯的病理改變,而TLR4+(C3H/HeN)組小鼠腎小管呈輕中度的病理改變,主要表現(xiàn)為近端腎小管管腔擴大、空泡形成等;與TLR4-(C3H/HeJ)組相比,TLR4+(C3H/HeN)組的TLR4蛋白及mRNA表達明顯上調;TUNEL法顯示凋亡小體主要出現(xiàn)在TLR4+(C3H/HeN)組小鼠腎臟的近端小管及管周圍
8、,腎小球無明顯凋亡小體出現(xiàn),TLR4-(C3H/HeJ)組小鼠腎組織中未檢測到凋亡小體,二者平均光密度值差異有顯著性(0.117±0.008 vs 0.038±0.003,P<0.001)。
結論:TLR4在LPS誘導的小鼠急性腎功能衰竭的發(fā)病中重要作用。LPS可能通過激活TLR4信號轉導途徑引起腎組織中腎小管上皮細胞凋亡過度,腎小管上皮細胞數(shù)量減少,從而導致急性腎功能衰竭的發(fā)生。
第二部分、脂多糖刺激下人腎
9、小管上皮細胞TLR4的表達研究
論文1:LPS促進人近端腎小管上皮細胞TLR4的表達
目的:研究人近端腎小管上皮細胞(HKC)在脂多糖(LPS)刺激下Toll樣受體4(TLR4)的表達及作用。
方法:實驗細胞分兩組,LPS刺激組(50ng/ml LPS加入體外培養(yǎng)的HKC)和正常對照組;應用免疫熒光染色在激光共聚焦顯微鏡下觀察LPS刺激24小時后TLR4在HKC中的分布及表達強弱;半定量RT-P
10、CR和免疫蛋白印跡檢測各組 TLR4及內參照β-actin在mRNA水平和蛋白水平的表達量;Annexin V-FITC結合流式細胞儀檢測各組細胞的早期凋亡率情況。
結果:LPS刺激組TLR4的免疫熒光強度顯著高于正常對照組,TLR4主要分布于HKC的胞膜及胞漿區(qū);刺激組TLR4 mRNA表達高于正常對照組(1.051±0.082 vs 0.38±0.036),差異有顯著性(P<0.01);刺激組TLR4蛋白表達高于正常對
11、照組(0.371±0.033 vs 0.105±0.008),差異有顯著性(P<0.01);LPS刺激組細胞的早期凋亡率(41.29[%])顯著高于正常對照組(2.36[%])。
結論:LPS能刺激HKC高表達TLR4,且促進HKC的早期凋亡,TLR4可能在LPS誘導的HKC凋亡中發(fā)揮一定的作用。
第三部分、特異性shRNA對HEK 293細胞和人腎小管上皮細胞TLR4表達抑制的作用研究
論文
12、1:特異性shRNA抑制HEK 293細胞TOLL樣受體4的表達
目的:研究RNA干擾法對人胚腎細胞(HEK 293)中Toll樣受體4(TLR4)表達的抑制作用。
方法:采用體外轉錄的方法生物合成針對TLR4分子設計的特異性短發(fā)卡RNA(shRNA)雙鏈分子,用脂質體轉染的方法導入體外培養(yǎng)的HEK293細胞;實驗細胞分三組:干擾組(將針對TLR4的特異性shRNA轉染正常HEK293細胞),陰性對照組(將非
13、特異性的陰性對照的shRNA轉染正常HEK293細胞)及正常組(無轉染);流式細胞儀檢測shRNA分子的轉染效率;應用免疫熒光染色在共聚焦顯微鏡下觀察TLR4的分布及表達強弱;半定量RT-PCR和免疫蛋白印跡檢測TLR4及內參照β-actin在mRNA水平和蛋白水平的表達量。
結果:特異性的針對TLR4的shRNA雙鏈分子在HEK293細胞的轉染率達82.47[%];干擾組TLR4的免疫熒光強度顯著低于陰性對照組及正常組細
14、胞,TLR4主要分布于HEK293 細胞的胞膜及胞漿區(qū)。干擾組細胞的TLR4 mRNA的光密度比值顯著低于陰性對照組及正常組(0.35±0.003 vs 0.98±0.061 vs 0.955±0.058);干擾組細胞的TLR4蛋白的光密度比值顯著低于陰性對照組及正常組(0.089±0.007 vs 0.153±0.011 vs 0.142±0.001)。
結論:采用生物體外轉錄的方法成功合成針對TLR4的shRNA雙鏈分
15、子,并有效地轉入HEK293細胞中使TLR4的表達下調。
論文2:特異性shRNA抑制LPS刺激下TLR4對人腎小管上皮細胞的促凋亡作用
目的:研究體外轉錄生物合成的shRNA對人腎小管上皮細胞(HKC)中Toll樣受體4(TLR4)表達及TLR4對HKC細胞促凋亡的抑制作用。
方法:用體外轉錄的方法生物合成針對TLR4分子的特異性短發(fā)卡RNA(shRNA)雙鏈分子,用脂質體轉染的方法導入在脂多
16、糖(LPS)刺激下的體外培養(yǎng)的HKC;實驗細胞分四組:LPS組(在培養(yǎng)的HKC中加入50ng/ml的LPS)、LPS+干擾組(在培養(yǎng)的HKC中加入50ng/ml的LPS的同時轉染針對TLR4的特異性shRNA雙鏈分子)、LPS+陰性對照組(在培養(yǎng)的HKC中加入50ng/ml的LPS的同時轉染非特異性的陰性對照的shRNA雙鏈分子)、正常組(不加LPS,也無轉染shRNA);應用免疫熒光染色在激光共聚焦顯微鏡下觀測TLR4的分布及表達強弱
17、;半定量RT-PCR和免疫蛋白印跡檢測TLR4及內參照β-actin在mRNA水平和蛋白水平的表達量;Annexin V-FITC結合流式細胞儀檢測各組細胞的早期凋亡率情況。
結果:LPS+干擾組細胞中TLR4的免疫熒光強度明顯低于LPS組和LPS+陰性對照組,與正常組的TLR4免疫熒光強度相當;LPS+干擾組細胞的TLR4 mRNA的光密度比值(0.198±0.041)明顯低于LPS組(0.445±0.049)和LPS+
18、陰性對照組(0.438±0.052),與正常組無明顯差異(0.152±0.038);LPS+干擾組細胞的TLR4蛋白的光密度比值(0.13±0.028)低于LPS組(0.307±0.035)和LPS+陰性對照組(0.283±0.032),與正常組無明顯差異(0.098±0.018);LPS+干擾組細胞的早期凋亡率(8.89[%])低于LPS組(43.57[%])和LPS+陰性對照組,與正常組細胞的早期凋亡率相當。
結論:采
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