TOLL樣受體4在脂多糖誘導的小鼠急性腎功能衰竭中的作用研究.pdf

1、第一部分、TOLL樣受體4在脂多糖誘導的小鼠急性腎功能衰竭中的表達及意義
　　 論文1：TLR4與小鼠內毒素型急性腎功能衰竭的相關性研究
　　 目的：研究TOLL樣受體4(TOLL like receptor 4，TLR4)與內毒素誘導的小鼠急性腎功能衰竭(ARF)的相關性關系。
　　 方法：建立脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)15mg/kg單次腹腔注射誘導雄性C57BL/6小鼠內毒素性急性

2、腎功能衰竭模型。分別于注射后第12h、24h、36h、48h的時間點采集血液及組織標本。檢測血肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)及用Nomura評分法對腎組織病理改變進行半定量評分。應用免疫組織化學SABC法對正常對照組(NG)及急性腎功能衰竭(ARF)組小鼠腎組織標本中的TLR4進行定位及半定量分析；Western blot檢測兩組腎組織總TLR4蛋白的改變；RT-PCR檢測各組小鼠腎組織總TLR4 mRNA的表達變化。TUNEL法檢測兩

3、組腎組織中凋亡小體情況。
　　 結果：注射LPS后模型組BUN、Cr逐漸上升，24h達高峰(BUN 28.14±2.55mmol/L，Cr 207.73±12.1μmol/L),約48h后逐漸恢復正常；與NG組相比，ARF組的TLR4蛋白及mRNA水平的表達顯著上調，以造模24h時最明顯；TUNEL法結果顯示凋亡小體主要出現(xiàn)在ARF組腎臟的近端小管及管周圍，腎小球無明顯變化。TLR4蛋白的光密度值與Cr、BUN值的相關系數(shù)分別為

4、0.907、0.926；與腎組織凋亡的光密度值的相關系數(shù)為0.954；腎組織凋亡的光密度值與Cr、BUN值的相關系數(shù)分別為0.932、0.951。
　　 結論：TLR4、腎組織凋亡均與小鼠內毒素型ARF的腎功能改變呈正相關關系，同時TLR4與腎組織凋亡也呈正相關關系，TLR4可能通過促進腎組織細胞凋亡參與ARF的發(fā)生。
　　 論文2：應用基因缺失小鼠研究TOLL樣受體4在脂多糖誘導的急性腎功能衰竭中的作用
　　

5、目的：進一步明確TOLL樣受體4(TLR4)在脂多糖(LPS)誘導的小鼠急性腎功能衰竭(ARF)腎臟中的作用機制。
　　 方法：以TLR4基因缺失的C3H/HeJ小鼠和其野生正常對照的C3H/HeN小鼠為實驗對象。實驗分TLR4+(C3H/HeN)組、TLR4-(C3H/HeJ)組小鼠，單次性腹腔注射LPS(15mg/kg)誘導小鼠ARF模型。24h后檢測血清肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)值來評估腎功能；Nomura評分法對腎組

6、織病理改變進行半定量評分；免疫組織化學SABC法檢測TLR4在兩組小鼠腎組織中的表達、RT-PCR法檢測腎組織總TLR4 mRNA的表達變化、免疫蛋白印跡檢測腎組織總TLR4蛋白水平；TUNEL法檢測腎臟組織的凋亡情況。
　　 結果：TLR4+(C3H/HeN)組的Cr、BUN分別為202.26±11.08umol/L、20.36±1.52mmol/L，TLR4-(C3H/HeJ)組的Cr、BUN分別為109.67±13.32u

7、mol/L、6.42±0.41mmol/L，差異有顯著性(P＜0.01)；TLR4-(C3H/HeJ)組的腎組織結構正常，無明顯的病理改變，而TLR4+(C3H/HeN)組小鼠腎小管呈輕中度的病理改變，主要表現(xiàn)為近端腎小管管腔擴大、空泡形成等；與TLR4-(C3H/HeJ)組相比，TLR4+(C3H/HeN)組的TLR4蛋白及mRNA表達明顯上調；TUNEL法顯示凋亡小體主要出現(xiàn)在TLR4+(C3H/HeN)組小鼠腎臟的近端小管及管周圍

8、，腎小球無明顯凋亡小體出現(xiàn)，TLR4-(C3H/HeJ)組小鼠腎組織中未檢測到凋亡小體，二者平均光密度值差異有顯著性(0.117±0.008 vs 0.038±0.003,P＜0.001)。
　　 結論：TLR4在LPS誘導的小鼠急性腎功能衰竭的發(fā)病中重要作用。LPS可能通過激活TLR4信號轉導途徑引起腎組織中腎小管上皮細胞凋亡過度，腎小管上皮細胞數(shù)量減少，從而導致急性腎功能衰竭的發(fā)生。
　　 第二部分、脂多糖刺激下人腎

9、小管上皮細胞TLR4的表達研究
　　 論文1：LPS促進人近端腎小管上皮細胞TLR4的表達
　　 目的：研究人近端腎小管上皮細胞(HKC)在脂多糖(LPS)刺激下Toll樣受體4(TLR4)的表達及作用。
　　 方法：實驗細胞分兩組，LPS刺激組(50ng/ml LPS加入體外培養(yǎng)的HKC)和正常對照組；應用免疫熒光染色在激光共聚焦顯微鏡下觀察LPS刺激24小時后TLR4在HKC中的分布及表達強弱；半定量RT-P

10、CR和免疫蛋白印跡檢測各組 TLR4及內參照β-actin在mRNA水平和蛋白水平的表達量；Annexin V-FITC結合流式細胞儀檢測各組細胞的早期凋亡率情況。
　　 結果：LPS刺激組TLR4的免疫熒光強度顯著高于正常對照組，TLR4主要分布于HKC的胞膜及胞漿區(qū)；刺激組TLR4 mRNA表達高于正常對照組(1.051±0.082 vs 0.38±0.036)，差異有顯著性(P＜0.01)；刺激組TLR4蛋白表達高于正常對

11、照組(0.371±0.033 vs 0.105±0.008)，差異有顯著性(P＜0.01)；LPS刺激組細胞的早期凋亡率(41.29[％])顯著高于正常對照組(2.36[％])。
　　 結論：LPS能刺激HKC高表達TLR4，且促進HKC的早期凋亡，TLR4可能在LPS誘導的HKC凋亡中發(fā)揮一定的作用。
　　 第三部分、特異性shRNA對HEK 293細胞和人腎小管上皮細胞TLR4表達抑制的作用研究
　　 論文

12、1：特異性shRNA抑制HEK 293細胞TOLL樣受體4的表達
　　 目的：研究RNA干擾法對人胚腎細胞(HEK 293)中Toll樣受體4(TLR4)表達的抑制作用。
　　 方法：采用體外轉錄的方法生物合成針對TLR4分子設計的特異性短發(fā)卡RNA(shRNA)雙鏈分子，用脂質體轉染的方法導入體外培養(yǎng)的HEK293細胞；實驗細胞分三組：干擾組(將針對TLR4的特異性shRNA轉染正常HEK293細胞)，陰性對照組(將非

13、特異性的陰性對照的shRNA轉染正常HEK293細胞)及正常組(無轉染)；流式細胞儀檢測shRNA分子的轉染效率；應用免疫熒光染色在共聚焦顯微鏡下觀察TLR4的分布及表達強弱；半定量RT-PCR和免疫蛋白印跡檢測TLR4及內參照β-actin在mRNA水平和蛋白水平的表達量。
　　 結果：特異性的針對TLR4的shRNA雙鏈分子在HEK293細胞的轉染率達82.47[％]；干擾組TLR4的免疫熒光強度顯著低于陰性對照組及正常組細

14、胞，TLR4主要分布于HEK293 細胞的胞膜及胞漿區(qū)。干擾組細胞的TLR4 mRNA的光密度比值顯著低于陰性對照組及正常組(0.35±0.003 vs 0.98±0.061 vs 0.955±0.058)；干擾組細胞的TLR4蛋白的光密度比值顯著低于陰性對照組及正常組(0.089±0.007 vs 0.153±0.011 vs 0.142±0.001)。
　　 結論：采用生物體外轉錄的方法成功合成針對TLR4的shRNA雙鏈分

15、子，并有效地轉入HEK293細胞中使TLR4的表達下調。
　　 論文2:特異性shRNA抑制LPS刺激下TLR4對人腎小管上皮細胞的促凋亡作用
　　 目的：研究體外轉錄生物合成的shRNA對人腎小管上皮細胞(HKC)中Toll樣受體4(TLR4)表達及TLR4對HKC細胞促凋亡的抑制作用。
　　 方法：用體外轉錄的方法生物合成針對TLR4分子的特異性短發(fā)卡RNA(shRNA)雙鏈分子，用脂質體轉染的方法導入在脂多

16、糖(LPS)刺激下的體外培養(yǎng)的HKC；實驗細胞分四組：LPS組(在培養(yǎng)的HKC中加入50ng/ml的LPS)、LPS+干擾組(在培養(yǎng)的HKC中加入50ng/ml的LPS的同時轉染針對TLR4的特異性shRNA雙鏈分子)、LPS+陰性對照組(在培養(yǎng)的HKC中加入50ng/ml的LPS的同時轉染非特異性的陰性對照的shRNA雙鏈分子)、正常組(不加LPS，也無轉染shRNA)；應用免疫熒光染色在激光共聚焦顯微鏡下觀測TLR4的分布及表達強弱

17、；半定量RT-PCR和免疫蛋白印跡檢測TLR4及內參照β-actin在mRNA水平和蛋白水平的表達量；Annexin V-FITC結合流式細胞儀檢測各組細胞的早期凋亡率情況。
　　 結果：LPS+干擾組細胞中TLR4的免疫熒光強度明顯低于LPS組和LPS+陰性對照組，與正常組的TLR4免疫熒光強度相當；LPS+干擾組細胞的TLR4 mRNA的光密度比值(0.198±0.041)明顯低于LPS組(0.445±0.049)和LPS+

18、陰性對照組(0.438±0.052)，與正常組無明顯差異(0.152±0.038)；LPS+干擾組細胞的TLR4蛋白的光密度比值(0.13±0.028)低于LPS組(0.307±0.035)和LPS+陰性對照組(0.283±0.032)，與正常組無明顯差異(0.098±0.018)；LPS+干擾組細胞的早期凋亡率(8.89[％])低于LPS組(43.57[％])和LPS+陰性對照組，與正常組細胞的早期凋亡率相當。
　　 結論：采