人腦膠質(zhì)瘤特異抗原肽白介素13α2受體基因表達質(zhì)粒的構(gòu)建及表達.pdf

1、目的： 通過對U251膠質(zhì)瘤細胞株傳代培養(yǎng)，并利用RT-PCR技術(shù)從U251細胞中擴增得到目的基因IL-13Rα2，體外構(gòu)建IL-13α2基因的重組表達質(zhì)粒，并通過原核表達技術(shù)和鎳柱純化技術(shù)得到IL-13α2抗原肽，為利用IL-13α2抗原肽單抗原免疫治療人腦膠質(zhì)瘤提供充分的理論依據(jù)及奠定堅實的實驗基礎。 方法： 用RT-PCR技術(shù)從U251膠質(zhì)瘤細胞株中擴增IL-13Rα2基因，經(jīng)膠回收測序鑒定正確后，以T-A

2、連接方式與克隆質(zhì)粒pMD19SimpleT載體連接進行體外連接，并轉(zhuǎn)入DH5α菌克隆，利用藍白斑篩選技術(shù)篩選重組陽性菌落，經(jīng)測序鑒定正確后用XhoⅠ和HindⅢ雙酶將目的基因從克隆質(zhì)粒上切下進行膠回收純化，并與同樣雙酶切后的表達質(zhì)粒pET-28a在T4DNA連接酶的作用下進行體外連接，轉(zhuǎn)入BL21(1)E3)菌，提取重組質(zhì)粒進行酶切及測序鑒定正確后，在IPTG誘導下原核表達IL-13Rα2抗原肽，并利用鎳柱進行純化回收，SDS-PAGE

3、檢測蛋白表達情況。 結(jié)果： 經(jīng)過三天培養(yǎng)后U251細胞呈貼壁生長，胞體大，呈梭形或多形性，并成功從其中擴增得到IL-13Rα2基因序列，大小為1142bp。通過酶切及測序鑒定后提示IL-13Rα2重組表達質(zhì)粒構(gòu)建成功，并在IPTG誘導下成功表達出IL-13Rα2抗原肽，大小為60KD，在IPTG濃度為0.8mmol/L，誘導溫度為35℃，誘導時間為3小時時表達量最高，以包涵體形式表達，經(jīng)鎳柱PH值梯度純化得到較純的IL-