干細(xì)胞相關(guān)基因MSI在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及功能研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是最為常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，約占全部腦腫瘤的一半以上，其起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。所有膠質(zhì)瘤生物學(xué)行為上都呈惡性表現(xiàn)，低級別膠質(zhì)瘤生長緩慢，復(fù)發(fā)進(jìn)展慢，而高級別膠質(zhì)瘤具有生長快、彌散性侵襲、復(fù)發(fā)快，進(jìn)展迅速，放化療易耐受抵抗等特點，盡管目前以手術(shù)為主的綜合治療如放射外科治療、術(shù)后放療、化療和免疫治療等已有了長足的進(jìn)步，高級別膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍較差，至今沒有取得實質(zhì)性進(jìn)展。目前認(rèn)為膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多因素參與、多步驟的復(fù)雜生物學(xué)過程

2、，與基因突變關(guān)系密切，是多基因參與的基因網(wǎng)絡(luò)失衡引起的。
　　腫瘤干細(xì)胞(tumor stem cells，TSCs)學(xué)說的提出為腫瘤的治療提供新的希望:腫瘤細(xì)胞群體中只有極少數(shù)的細(xì)胞具有干細(xì)胞特點，能無限增殖并能自我更新維持干細(xì)胞庫的穩(wěn)定，這種腫瘤干細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和復(fù)發(fā)中發(fā)揮著關(guān)鍵根源性作用。如果治療只殺滅了腫瘤細(xì)胞中不具備無限增殖能力的非干性細(xì)胞，而腫瘤干細(xì)胞存活下來，那么這部分腫瘤干細(xì)胞勢必繼續(xù)增殖分化形成新的復(fù)發(fā)灶

3、，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)。因此，腫瘤治療的成敗主要取決于其中的腫瘤干細(xì)胞的清除。膠質(zhì)瘤是最早鑒定并分離出腫瘤干細(xì)胞的腫瘤之一，腦腫瘤干細(xì)胞(Brain tumor stem cells，BTSCs)具有極強的免疫逃避、放療耐受、化療耐藥及遠(yuǎn)處遷移等特點，使得膠質(zhì)瘤尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對治療表現(xiàn)出極大的抵抗，常規(guī)的治療方法很難以根除。但是目前關(guān)于腫瘤干細(xì)胞特異性標(biāo)志、腫瘤干細(xì)胞起源、維持自我更新的機制尚不完全清楚。如果能夠揭示腫瘤干細(xì)胞的這些機制，

4、就可以采用相應(yīng)的干預(yù)，誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞的分化，而抑制腫瘤生長。因此，膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究，尤其是其分子特異性標(biāo)志物、腫瘤干細(xì)胞自我更新的維持機制等研究有望成為攻克膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵。
　　目前用于鑒定、分離腦腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物一般都是神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志物，而腫瘤干細(xì)胞本身沒有特異性標(biāo)志物。CD133(Prominin-1), SOX2, Nestin, Bmi(1), Musashi(1), CD44, CD15，和ABC轉(zhuǎn)運蛋白是最

5、常用的鑒定和分離腫瘤干細(xì)胞的分子標(biāo)志。目前的很多研究已經(jīng)表明，單一的標(biāo)志物作為腦腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物極不穩(wěn)定與恰當(dāng)，多個標(biāo)志聯(lián)合可能更準(zhǔn)確。尋找腦腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物是腫瘤干細(xì)胞研究與治療的基礎(chǔ)，所以尋找腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的腳步從未停止。
　　MSI基因(Musashi)編碼的RNA綁定蛋白最初在果蠅中發(fā)現(xiàn)，與果蠅硬毛的非對稱發(fā)育有關(guān)。隨后陸續(xù)在其他真核物種如蛙、小鼠、人等被發(fā)現(xiàn)，有兩個進(jìn)化上高度保守的同源基因MSI1和MSI2。MSI作

6、為RNA綁定蛋白在基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的過程中起著重要的作用，參與RNA剪接、序列編輯、多聚腺苷化作用、RNA轉(zhuǎn)運、維持RNA的穩(wěn)定和調(diào)控RNA降解、細(xì)胞內(nèi)定位和控制翻譯等調(diào)控過程。已有研究證實MSI參與調(diào)控Notch信號通路，在神經(jīng)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的自我更新維持中發(fā)揮著重要的作用。MSI1基因是研究最為廣泛的MSI家族基因，在多種惡性腫瘤如膠質(zhì)瘤、腸癌等中高表達(dá)，并且是預(yù)后不良的獨立危險因素。最新研究發(fā)現(xiàn)MSI2基因在造血系統(tǒng)干細(xì)胞和

7、造血系統(tǒng)惡性腫瘤干細(xì)胞中高表達(dá)并參與干細(xì)胞干性維持的調(diào)節(jié)，是預(yù)后不良的指標(biāo)。雖已有研究發(fā)現(xiàn)MSI1基因在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，但關(guān)于MSI1基因在膠質(zhì)瘤中的功能研究尚未見報道，而MSI2基因在膠質(zhì)瘤中的研究尚未見報道。MSI基因是否在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自我更新維持中發(fā)揮重要作用仍然未知。本研究擬從人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本及膠質(zhì)瘤細(xì)胞系著手，系統(tǒng)研究MSI基因在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)、功能及其可能的作用機制。
　　[MSI基因在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及與腫瘤干細(xì)

8、胞的關(guān)系]
　　本研究首先采用RT-PCR方法檢測72例不同級別膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本及8例正常腦組織中MSI1和MSI2基因的表達(dá)，結(jié)果顯示在膠質(zhì)瘤中MSI1和MSI2基因均較正常腦組織上調(diào)表達(dá)，而且表達(dá)水平與級別正相關(guān)，表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而與腫瘤大小、性別、年齡等因素?zé)o關(guān)。同樣采用RT-PCR方法檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251、U87、T98G中MSI基因的表達(dá)，結(jié)果顯示MSI1和MSI2基因在膠質(zhì)母細(xì)胞細(xì)胞系中有明顯

9、表達(dá)。
　　我們接著采用免疫組化技術(shù)分析MSI蛋白在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及分布。為對實驗條件標(biāo)一化，我們將臨床收集的72例膠質(zhì)標(biāo)本及8例正常腦組織標(biāo)本制作成組織芯片。免疫組化結(jié)果顯示MSI1和MSI2蛋白在膠質(zhì)瘤細(xì)胞胞漿和胞核中表達(dá)，在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)較正常腦組織明顯增強，且在高級別膠質(zhì)瘤中較低級別膠質(zhì)瘤表達(dá)明顯增強，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而與腫瘤大小、年齡、性別等無關(guān)。這些結(jié)果說明MSI1和MSI2與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展

10、可能密切相關(guān)。
　　我們進(jìn)一步分析了MSI的表達(dá)與腫瘤干細(xì)胞的關(guān)系，同樣采用免疫組化技術(shù)分析組織芯片中傳統(tǒng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞標(biāo)志Nestin及ALDH1的表達(dá)，采用Spearman相關(guān)系數(shù)法分析MSI表達(dá)與干細(xì)胞標(biāo)志的關(guān)系。結(jié)果顯示MSI1和MSI2的免疫積分與組織中Nestin及ALDH1陽性細(xì)胞率呈明顯相關(guān)性，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，說明MSI的表達(dá)與腫瘤干細(xì)胞相關(guān)。
　　我們接著采用腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)方法在膠質(zhì)瘤細(xì)胞

11、系U251、U87、T98G中分離培養(yǎng)腫瘤干細(xì)胞球，經(jīng)Nestin免疫熒光及分化培養(yǎng)鑒定后，以普通培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照，采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)分析MSI在腫瘤球中的表達(dá)，結(jié)果顯示，在普通培養(yǎng)條件下，約60％腫瘤細(xì)胞表達(dá)MSI1，40％腫瘤細(xì)胞表達(dá)MSI2，在腫瘤干細(xì)胞球中幾乎所有細(xì)胞均有MSI1和MSI2的表達(dá)。抽提腫瘤球細(xì)胞總RNA及蛋白，分別采用qPCR技術(shù)及western blot技術(shù)分析MSI1、MSI2和Nestin的表

12、達(dá)，結(jié)果顯示，在腫瘤球中MSI1、MSI2和Nestin基因mRNA及蛋白水平均高于普通培養(yǎng)細(xì)胞，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，進(jìn)一步說明MSI1和MSI2基因為膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因。
　　因此，我們的研究發(fā)現(xiàn)MSI基因在膠質(zhì)瘤中表達(dá)并與腫瘤干細(xì)胞密切相關(guān)，可能在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展及腫瘤干細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，為進(jìn)一步研究提供了實驗基礎(chǔ)。
　　[MSI基因在膠質(zhì)瘤中的功能]
　　采用RNA干擾進(jìn)一步研究MSI基因

13、在膠質(zhì)瘤中的功能。首先根據(jù)MSI1和MSI2基因序列設(shè)計干擾序列，化學(xué)合成si-RNA并利用RNAi MAX導(dǎo)入U251細(xì)胞，qPCR檢測干擾效率，篩選出干擾效率最高的si-RNA序列。為了能更好研究基因功能，我們根據(jù)篩選出的干擾效率最高的siRNA序列合成寡核苷酸鏈，構(gòu)建sh-RNAi-EGFP慢病毒載體，測序正確無誤后與輔助載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，病毒經(jīng)濃縮，滴度測定及鑒定后濃縮后病毒測定病毒滴定達(dá)到實驗要求，成功構(gòu)建s

14、h-MSI慢病毒。
　　分別將sh-MSI1、sh-MSI2及sh-control慢病毒感染U251細(xì)胞。以sh-control組作為對照，qPCR檢測干擾后MSI基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，sh-MSI1組MSI1基因為對照組0.13倍，而MSI2基因為對照組1.43倍，sh-MSI2組MSI2基因為對照組0.16倍，MSI1基因反應(yīng)性升高為1.34倍，在shMSI1+sh-MSI2組，MSI1是對照組的0.16倍而MSI2是對照組的

15、0.19倍，因此我們構(gòu)建的慢病毒干擾載體能有效沉默靶基因，同時發(fā)現(xiàn)當(dāng)干擾MSI基因中一個基因，其同源基因能反應(yīng)性表達(dá)上調(diào)，也說明其兩者在功能上可能具有重疊性。
　　我們接著檢測了MSI基因沉默后對U251細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。利用MTT方法觀察MSI基因沉默后對細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示shMI1組、shMSI2組細(xì)胞增殖能力較對照組明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，sh-MSI1+sh-MSI2能進(jìn)一步影響細(xì)胞增殖，但

16、結(jié)果較單一干擾組尚不具統(tǒng)計學(xué)意義。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示sh-MSI1、sh-MSI2組細(xì)胞在G2/M期數(shù)量明顯增加(P＜0.05)，而G0/G1期及S期細(xì)胞比例明顯下降(P＜0.05)，sh-MSI1+shMSI2組改變更為明顯。AnnexinV/PI流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示shMSI1組及sh-MSI2組早期細(xì)胞凋亡及晚期細(xì)胞凋亡較對照組明顯增加（P＜0.05）。另外，劃痕實驗、遷移實驗和基質(zhì)膠侵襲實驗結(jié)果顯示sh-MSI1組及

17、sh-MSI2組細(xì)胞遷移侵襲能力明顯降低，而sh-MSI1+shMSI2組較單一干擾組遷移侵襲能力進(jìn)一步降低(P＜0.05)。上述結(jié)果提示MSI基因可能在膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的功能中發(fā)揮重要作用，可能為候選癌基因。
　　采用平板克隆實驗觀察克隆形成能力，結(jié)果顯示sh-MSI1組及sh-MSI2組克隆形成能力明顯下降，sh-MSII+MSI2組克隆形成能力進(jìn)一步下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。進(jìn)一步采用極倍稀釋法檢測MS

18、I基因沉默對細(xì)胞在干細(xì)胞培養(yǎng)基中腫瘤球形成能力來判斷MSI基因?qū)τ谀[瘤干細(xì)胞的自我更新能力的影響，結(jié)果顯示sh-MSI1組及sh-MSI2組腫瘤球形成率明顯低于對照組(P＜0.05)。提示干細(xì)胞相關(guān)基因MSI基因可能在腫瘤干細(xì)胞自我更新維持中發(fā)揮重要作用。
　　[MSI2基因發(fā)揮作用機制的初步研究]
　　Wnt信號通路是干細(xì)胞干性維持中的重要信號通路，并且在膠質(zhì)瘤中異常激活，前期研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路關(guān)鍵分子β-Cateni

19、n在膠質(zhì)瘤中上調(diào)表達(dá)。為了進(jìn)一步探討MSI2基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中發(fā)揮作用的可能分子機制，采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析，結(jié)果顯示，β-catenin免疫積分與MSI2的免疫積分顯著正相關(guān)（r=0.872，P＜0.001）。進(jìn)一步采用western blot技術(shù)分析sh-MSI2-U251細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)，結(jié)果顯示sh-MSI2組細(xì)胞中β-catenin表達(dá)較sh-control組明顯下調(diào)(P＜0.05)，說明MSI2基因可

20、能通過wnt信號通路發(fā)揮作用。
　　進(jìn)一步采用qPCR檢測wnt信號通路抑制因子Dkk(1)的表達(dá)，結(jié)果顯示sh-MSI2-U251組中Dkk(1)的表達(dá)為對照組sh-control-U251組的3.14倍，顯著上調(diào)(P＜0.05)。
　　這些結(jié)果提示MSI2基因在膠質(zhì)瘤中可能通過抑制DKK1的表達(dá)激活wnt信號通路而發(fā)揮調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞自我更新作用，雖有待進(jìn)一步實驗證實，但為研究提供了基礎(chǔ)及方向。
　　綜上所述，本研究

21、首次系統(tǒng)地研究了MSI1和MSI2基因在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)、與腫瘤干細(xì)胞關(guān)系、在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的功能以及在對腫瘤干細(xì)胞自我更新維持中的作用，并初步探討了MSI2基因與wnt信號通路之間的關(guān)系。結(jié)果顯示:MSI1和MSI2基因在人腦膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，與腫瘤干細(xì)胞密切相關(guān)，為潛在的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志分子。MSI1和MSI2基因沉默后，顯著抑制細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，使細(xì)胞停滯在G2/M期而S期細(xì)胞減少，增加細(xì)胞凋亡而降低其惡性表現(xiàn);并能抑