靶向HER-2的siRNA治療乳腺癌的實驗研究.pdf

1、HER-2(c-erbB-2，neu)基因是EGF受體家族的重要成分，它在20％～40％的乳腺癌中高表達(dá)，并與乳腺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、預(yù)后密切相關(guān)。HER-2高表達(dá)的乳腺癌患者采用化療、放療、內(nèi)分泌治療及聯(lián)合治療等多種治療手段無顯著療效，且預(yù)后不良。目前，HER-2基因或p185HER-2蛋白已經(jīng)成為乳腺癌治療的理想靶點。其中人源化單克隆抗體Herceptin(赫賽汀)是第一個針對HER-2陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療藥物，也是第一個靶向乳腺癌的

2、生物治療藥物，已被批準(zhǔn)用于臨床，并取得令人鼓舞的療效。但抗體藥物作用于p185HER-2蛋白，并不能從根本上抑制HER-2基因的表達(dá)。而基于反義技術(shù)的基因治療則可以更直接、更有效地抑制HER-2基因的表達(dá)。目前，針對特定基因mRNA的RNA干涉(RNAinterference，RNAi)技術(shù)為基因治療提供了新方法。RNAi藥物可以有選擇地使目標(biāo)基因失活，并克服蛋白質(zhì)藥物的諸多缺點。雖然對RNAi藥物的研究才剛起步，但已取得很大進(jìn)展。本研

3、究的目的就是找到具有較好干涉效果的小干涉RNA(smallinterferingRNA，siRNA)，實現(xiàn)對乳腺癌細(xì)胞中HER-2表達(dá)的高效抑制，并最終用于對HER-2高表達(dá)乳腺癌的基因治療。 首先，通過GenBank獲得了6條人HER-2mRNA序列，其中被研究較多的是長度為4624bp的HER-2mRNA序列(序列號為NM004448.2)，與其它HER-2mRNA序列都具有較高的同源性，且其編碼區(qū)(codingDNAseq

4、uence，CDS)也最完整。因此，我們以4624bpHER-2mRNA為靶序列，從mRNA序列的AUG起始密碼子開始，在編碼區(qū)內(nèi)尋找“AA”二核苷酸序列，并且選擇GC含量在40％～50％的序列，最終設(shè)計了5條siRNA。并構(gòu)建了表達(dá)發(fā)夾siRNA的質(zhì)粒載體pSilencer-HER-2，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7乳腺癌細(xì)胞，經(jīng)篩選得到5種穩(wěn)定表達(dá)發(fā)夾siRNA的細(xì)胞株。然后。分別在mRNA和蛋白水平上檢測了siRNA對HER-2表達(dá)的抑制作

5、用。結(jié)果顯示，5條siRNA均能明顯降低細(xì)胞中HER-2mRNA的表達(dá)，其中3P的抑制作用最強。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測了穩(wěn)定表達(dá)siRNA細(xì)胞表面HER-2蛋白的表達(dá)水平，檢測結(jié)果表明，穩(wěn)定表達(dá)siRNA的2P和3P轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面HER-2的表達(dá)被明顯抑制。將這些穩(wěn)定表達(dá)siRNA的細(xì)胞株接種裸鼠進(jìn)行成瘤性實驗，結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞相比，穩(wěn)定表達(dá)siRNA的MCF-7細(xì)胞的成瘤性均有所降低。通過免疫組化檢測瘤組織中HER-

6、2蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，穩(wěn)定表達(dá)siRNA的MCF-7細(xì)胞形成的腫瘤組織中HER-2蛋白的表達(dá)也被明顯抑制。 我們還對長度為4624bp的HER-2mRNA進(jìn)行了二級結(jié)構(gòu)模擬，分析了siRNA靶序列位點的局部二級結(jié)構(gòu)，希望能夠找到靶序列二級結(jié)構(gòu)與siRNA干涉效果之間的關(guān)系。將全序列提交mfold專業(yè)網(wǎng)站進(jìn)行了模擬，獲得一個最優(yōu)結(jié)構(gòu)和九個次優(yōu)結(jié)構(gòu)。選用最優(yōu)結(jié)構(gòu)提取靶位點處的局部二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3P和2P的siRNA

7、靶序列中的單鏈區(qū)域較多，即未配對堿基所占比例較大，分別為13/19和7/19，其余三條靶序列中的堿基幾乎完全配對形成雙鏈。結(jié)合第一部分實驗結(jié)果可知，3P和2PsiRNA對HER-2的干涉效果較好，其余三條siRNA的干涉作用稍差。因此，很可能siRNA靶序列局部的非配對堿基的數(shù)量直接影響siRNA的干涉效率。如果靶序列中非配對堿基所占比例大，則很可能siRNA易于與靶mRNA相結(jié)合，從而引起的RNA干涉的效應(yīng)比較強。因此，有效的RNA干

8、涉除了受siRNA本身的結(jié)構(gòu)和功能特點影響外，siRNA靶RNA的局部結(jié)構(gòu)也直接影響其干涉效果。 為了實現(xiàn)在動物體內(nèi)進(jìn)行乳腺癌的基因治療，我們又構(gòu)建了能高表達(dá)發(fā)夾siRNA的重組腺病毒載體pAd-siRNA-HER-2。以構(gòu)建的表達(dá)發(fā)夾siRNA的質(zhì)粒載體pSilencer-HER-2為模板，擴增U6-siRNA片段，再將其定向插入到pShuttle-CMV的CMV啟動子下游，然后采用細(xì)菌內(nèi)同源重組的方法制備重組腺病毒載體。經(jīng)H

9、EK293細(xì)胞的包裝、擴增獲得了具有感染力的Ad-siRNA-HER-2重組腺病毒顆粒。為進(jìn)一步利用表達(dá)siRNA的重組腺病毒在體內(nèi)實現(xiàn)乳腺癌的特異性基因治療奠定了基礎(chǔ)。 總之，本研究以全長人HER-2mRNA為靶，設(shè)計了用于干涉HER-2表達(dá)的siRNA，在細(xì)胞水平和活體水平上分析了其干涉HER-2表達(dá)的效果，找到了一條干涉效果較好的siRNA。同時，分析了siRNA靶序列與siRNA干涉效果之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)siRNA靶序列的