質(zhì)粒介導(dǎo)HER-2 RNA干擾治療HER-2陽性乳腺癌體內(nèi)外研究.pdf

1、近年來，我國乳腺癌的發(fā)病率迅速上升。乳腺癌已經(jīng)是危害我國婦女健康的主要惡性腫瘤之一。約有25-30％乳腺癌病人的癌組織表達HER-2，而且這些HER-2陽性的病例往往發(fā)展快，對多種化療和內(nèi)分泌治療不敏感，預(yù)后較差，容易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。 HER-2是具有跨膜酪氨酸激酶活性的生長因子受體，分子量約為185kD，又被稱為p185，它是人類表皮生長因子受體(EGFR)家族中的成員之一。目前抗HER-2治療的途徑主要有以下幾類：(1)抗HER-

2、2單克隆抗體，通過封閉乳腺癌細胞表面HER-2受體，阻斷其與各種生長因子的結(jié)合，從而抑制受體激活；(2)酪氨酸激酶抑制劑；(3)反義基因技術(shù)。但由于抗HER-2單克隆抗體本身限制及酪氨酸激酶抑制劑副作用較嚴重，而反義基因方法抑制基因表達的效果又較弱，故他們都不能達到滿意的臨床效果。因此，開發(fā)一種更加有效、安全的抗HER-2藥物成為研究的熱點。 因此本課題設(shè)計了以HER-2/neu基因為靶標(biāo)的siRNA插入片斷，構(gòu)建HER-2-s

3、hRNA表達質(zhì)粒載體，觀察其對乳腺癌SKBR-3細胞株HER-2mRNA及HER-2蛋白表達的影響，并觀察其對細胞增殖能力和凋亡的影響及對化療藥物敏感性的影響；同時在體內(nèi)研究其抑制HER-2陽性腫瘤生長抑制情況。 材料與方法HER-2-shRNA目的序列的篩選及表達載體的構(gòu)建和鑒定 根據(jù)Tuchle經(jīng)典siRNA設(shè)計方法設(shè)計并選取HER-2/neu基因特異的、并且與其他HER家族成員同源性最小的siRNA序列。根據(jù)載體p

4、silencer1.0-U6(pU6)的ApaI和EcoRI酶切位點設(shè)計插入的DNA寡核苷酸片段序列。psilencer1.0-U6經(jīng)過擴增、抽提、雙酶切、線性質(zhì)粒純化后，與退火處理的雙鏈DNA片段進行連接重組。重組質(zhì)粒進行HindⅢ酶切初步篩選后，測序鑒定。 對照質(zhì)粒為已經(jīng)重組構(gòu)建成功的GFP-shRNApsilencer1.0-U6質(zhì)粒載體。細胞培養(yǎng)、細胞轉(zhuǎn)染及實驗分組SKBR-3細胞用高糖DMEM培養(yǎng)基，置于含5％CO2，

5、37℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗分組為對照組(轉(zhuǎn)染試劑)、GFP-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染試劑+GFP-shRNA質(zhì)粒)、HER-2-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染試劑+HER-2-shRNA質(zhì)粒)三組。 第一天細胞鋪板，鋪板密度分別為：6孔板5×105個/孔；24孔板1×105個/孔；96孔板5×103個/孔。第二天至細胞密度達到70-80％時開始轉(zhuǎn)染。用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000，轉(zhuǎn)染72小時后進行檢

6、測。 半定量RT-PCR檢測細胞轉(zhuǎn)染后mRNA水平HER-2/neu基因表達的影響 Trizol試劑分別提取各組細胞的總RNA，以HER-2和β-actin相應(yīng)引物進行半定量RT-PCR，瓊脂糖凝膠電泳后在觀察照相。然后以KontrinIbas全自動圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析。 Wenten-Blot及免疫組化分析細胞轉(zhuǎn)染后HER-2蛋白表達的情況 將各處理組細胞裂解并提取細胞蛋白，進行SDS-PAGE電泳

7、，然后小鼠抗人HER-2/neu單克隆抗體和β-actin單克隆抗體為一抗進行Westernblot。ECL化學(xué)發(fā)光曝光后進行圖像分析。 轉(zhuǎn)染前，在6孔板預(yù)置蓋玻片，染72小時后，提取蓋玻片，清洗后，用免疫組化SABC方法分析HER-2表達情況。 流式細胞儀(FCM)檢測細胞周期及TUNEL(DNA切口末端標(biāo)記法)分析細胞凋亡情況 各處理組細胞以70％冰乙醇，固定過夜，然后以RNA酶處理和PI染料染色，流式細胞儀

8、進行檢測。 取轉(zhuǎn)染后各組的細胞爬片，多聚甲醛室溫固定后，按照細胞凋亡檢測試劑盒(InSituCellDeathDetectionKit)說明進行操作。DAB顯色后計數(shù)細胞，計算凋亡細胞百分比。 MTT法檢測腫瘤細胞生長及對化療藥物的敏感性 SKBR-3乳腺癌細胞株以5×103/孔接種細胞至96孔板上，細胞轉(zhuǎn)染72h之后加MTT孵育4h，酶標(biāo)儀檢測光密度。以pU6轉(zhuǎn)染組為空白對照組，計算各轉(zhuǎn)染組相對空白對照組的百分

9、比，測定細胞活力。 同上述方法相同，轉(zhuǎn)染后72小時，將不同濃度表阿霉素加入各組細胞，48小時后測試細胞活力。 HER-2陽性動物模型及原位乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型的建立 4-6周齡雌性裸小鼠，在第二對乳房墊原位種植5×106個SKBR-3細胞，形成腫瘤后再將腫瘤移植到裸鼠第二對乳房墊，放在SPF環(huán)境中飼養(yǎng)，形成原位HER-2陽性乳腺癌模型。 原位肝轉(zhuǎn)移模型的建立在正常環(huán)境下進行。在SKBR-3細胞在體內(nèi)形成腫瘤后

10、，取腫瘤種植在裸鼠原位，等到裸鼠腫瘤長成后，取其中一只再進行裸鼠腫瘤原位移植，觀察裸鼠的腫瘤生長情況及肝肺轉(zhuǎn)移情況。 載體介導(dǎo)的RNA干擾藥物傳遞及觀察 實驗動物按照空白對照，陰性對照及治療分為三組?？瞻捉M無任何處理，陰性對照注射GFPshRNA，治療組注射HER-2shRNA；將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染藥物同載體介導(dǎo)的RNA干擾藥物混合，在體外孵育20分鐘后，按照腫瘤體積大小分別將其注射到正常環(huán)境及SPF環(huán)境下的動物模型腫瘤內(nèi)，每周

11、觀察腫瘤大小及動物生存狀態(tài)。 結(jié)果重組質(zhì)粒的篩選和鑒定 HER-2-shRNA表達載體重組構(gòu)建成功，酶切初步篩選后，測序鑒定序列完全正確。 半定量RT-PCR檢測細胞轉(zhuǎn)染后mRNA水平HER-2基因表達的影響 HER-2-shRNApU6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SKBR-3細胞72h后，HER-2mRNA水平較對照組有明顯下降(下降約60％左右)；GFP-shRNApU6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞的HER-2mRNA水平較對照組無明

12、顯變化。 Wenten-Blot及免疫組化分析細胞轉(zhuǎn)染后HER-2蛋白表達的情況 細胞轉(zhuǎn)染72h后，提取各處理組細胞蛋白，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和Westernblot檢測，成像后進行圖像分析，分析結(jié)果顯示HER-2-shRNApU6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞的HER-2蛋白水平較對照組下降55％左右；GFP-shRNApU6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞的HER-2蛋白水平無明顯變化。 HER-2免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過HER-2sh

13、RNApU6轉(zhuǎn)染后，HER-2在細胞膜上的表達明顯降低，而兩個對照組沒有明顯變化。 HER-2基因干擾對SKBR-3細胞周期分布的影響及凋亡的影響 流式細胞儀檢測結(jié)果顯示：HER-2-shRNA轉(zhuǎn)染組的G0/G1期細胞比例較對照組增加約9％左右，并且凋亡細胞比率增加；而GFP-shRNA轉(zhuǎn)染組和對照組G0/G1期細胞比例、凋亡細胞比率幾乎沒有明顯差別。 SKBR-3細胞轉(zhuǎn)染后，用TUNEL法分細胞凋亡，計數(shù)凋亡細

14、胞數(shù)，計算凋亡細胞百分比。結(jié)果為：HER-2-shRNApU6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組凋亡細胞百分比較對照組增加6.3％；GFP-shRNApU6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和對照組間無明顯差異。 MTT法檢測HER-2基因干擾對腫瘤細胞生長及對化療敏感性的影響 HER-2-shRNApU6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染抑制HER-2/neu基因表達能明顯抑制SKBR-3細胞生長。細胞轉(zhuǎn)染后，HER-2-shRNAPu6轉(zhuǎn)染組細胞生長分布不均，成片狀。MTT結(jié)果顯示該組細胞

15、生長活力明顯減弱(P＜0.05)。 HER-2-shRNApU6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染提高了SKBR-3細胞對化療藥物表阿霉素的敏感性，相比對照組，腫瘤細胞對表阿霉素的敏感性增加了10多倍。 HER-2陽性原位乳腺癌模型及原位乳腺癌肝轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)模型的建立 所有在SPF環(huán)境或者非SPF環(huán)境下的原位HER-2陽性腫瘤模型都獲得成功，在非SPF環(huán)境下沒有出現(xiàn)明顯的并發(fā)癥及動物死亡。 經(jīng)過3次體內(nèi)篩選，正常飼養(yǎng)環(huán)境下，腫瘤的惡性度出

16、現(xiàn)增加，腫瘤出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移的頻率明顯增高，達到81％，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的肺轉(zhuǎn)移。 體內(nèi)HER-2shRNA抑制HER-2陽性乳腺腫瘤的生長 經(jīng)過10周觀察，沒有動物出現(xiàn)非腫瘤性死亡。在10周時，腫瘤的大小在HER-2shRNA比兩個對照組明顯要小，分別為3661.99±825.65mm3及3776.30±675.65mm3，1927.56±425.09mm3(p＜0.05)；抑制效果在腫瘤較小的時候更明顯，尤其是當(dāng)腫瘤直徑小于0

17、.5cm時。 結(jié)論1.表達HER-2-shRNA的重組psilencer1.0-U6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，明顯地抑制乳腺癌SKBR-3細胞HER-2mRNA和蛋白的表達水平。 2.HER-2-shRNApU6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，HER-2基因干擾可以抑制乳腺癌細胞SKBR-3的生長，并引起細胞阻滯在G0/G1期。 3.HER-2-shRNApU6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，HER-2基因干擾可以誘導(dǎo)乳腺癌細胞SKBR-3凋亡。 4.HER-2