質(zhì)粒介導(dǎo)HER-2 RNA干擾治療HER-2陽(yáng)性乳腺癌體內(nèi)外研究.pdf

1、近年來(lái)，我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率迅速上升。乳腺癌已經(jīng)是危害我國(guó)婦女健康的主要惡性腫瘤之一。約有25-30％乳腺癌病人的癌組織表達(dá)HER-2，而且這些HER-2陽(yáng)性的病例往往發(fā)展快，對(duì)多種化療和內(nèi)分泌治療不敏感，預(yù)后較差，容易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。 HER-2是具有跨膜酪氨酸激酶活性的生長(zhǎng)因子受體，分子量約為185kD，又被稱為p185，它是人類表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)家族中的成員之一。目前抗HER-2治療的途徑主要有以下幾類：(1)抗HER-

2、2單克隆抗體，通過(guò)封閉乳腺癌細(xì)胞表面HER-2受體，阻斷其與各種生長(zhǎng)因子的結(jié)合，從而抑制受體激活；(2)酪氨酸激酶抑制劑；(3)反義基因技術(shù)。但由于抗HER-2單克隆抗體本身限制及酪氨酸激酶抑制劑副作用較嚴(yán)重，而反義基因方法抑制基因表達(dá)的效果又較弱，故他們都不能達(dá)到滿意的臨床效果。因此，開(kāi)發(fā)一種更加有效、安全的抗HER-2藥物成為研究的熱點(diǎn)。 因此本課題設(shè)計(jì)了以HER-2/neu基因?yàn)榘袠?biāo)的siRNA插入片斷，構(gòu)建HER-2-s

3、hRNA表達(dá)質(zhì)粒載體，觀察其對(duì)乳腺癌SKBR-3細(xì)胞株HER-2mRNA及HER-2蛋白表達(dá)的影響，并觀察其對(duì)細(xì)胞增殖能力和凋亡的影響及對(duì)化療藥物敏感性的影響；同時(shí)在體內(nèi)研究其抑制HER-2陽(yáng)性腫瘤生長(zhǎng)抑制情況。 材料與方法HER-2-shRNA目的序列的篩選及表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 根據(jù)Tuchle經(jīng)典siRNA設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)并選取HER-2/neu基因特異的、并且與其他HER家族成員同源性最小的siRNA序列。根據(jù)載體p

4、silencer1.0-U6(pU6)的ApaI和EcoRI酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)插入的DNA寡核苷酸片段序列。psilencer1.0-U6經(jīng)過(guò)擴(kuò)增、抽提、雙酶切、線性質(zhì)粒純化后，與退火處理的雙鏈DNA片段進(jìn)行連接重組。重組質(zhì)粒進(jìn)行HindⅢ酶切初步篩選后，測(cè)序鑒定。 對(duì)照質(zhì)粒為已經(jīng)重組構(gòu)建成功的GFP-shRNApsilencer1.0-U6質(zhì)粒載體。細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及實(shí)驗(yàn)分組SKBR-3細(xì)胞用高糖DMEM培養(yǎng)基，置于含5％CO2，

5、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組(轉(zhuǎn)染試劑)、GFP-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染試劑+GFP-shRNA質(zhì)粒)、HER-2-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染試劑+HER-2-shRNA質(zhì)粒)三組。 第一天細(xì)胞鋪板，鋪板密度分別為：6孔板5×105個(gè)/孔；24孔板1×105個(gè)/孔；96孔板5×103個(gè)/孔。第二天至細(xì)胞密度達(dá)到70-80％時(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)染。用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000，轉(zhuǎn)染72小時(shí)后進(jìn)行檢

6、測(cè)。 半定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后mRNA水平HER-2/neu基因表達(dá)的影響 Trizol試劑分別提取各組細(xì)胞的總RNA，以HER-2和β-actin相應(yīng)引物進(jìn)行半定量RT-PCR，瓊脂糖凝膠電泳后在觀察照相。然后以KontrinIbas全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。 Wenten-Blot及免疫組化分析細(xì)胞轉(zhuǎn)染后HER-2蛋白表達(dá)的情況 將各處理組細(xì)胞裂解并提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳

7、，然后小鼠抗人HER-2/neu單克隆抗體和β-actin單克隆抗體為一抗進(jìn)行Westernblot。ECL化學(xué)發(fā)光曝光后進(jìn)行圖像分析。 轉(zhuǎn)染前，在6孔板預(yù)置蓋玻片，染72小時(shí)后，提取蓋玻片，清洗后，用免疫組化SABC方法分析HER-2表達(dá)情況。 流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期及TUNEL(DNA切口末端標(biāo)記法)分析細(xì)胞凋亡情況 各處理組細(xì)胞以70％冰乙醇，固定過(guò)夜，然后以RNA酶處理和PI染料染色，流式細(xì)胞儀

8、進(jìn)行檢測(cè)。 取轉(zhuǎn)染后各組的細(xì)胞爬片，多聚甲醛室溫固定后，按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(InSituCellDeathDetectionKit)說(shuō)明進(jìn)行操作。DAB顯色后計(jì)數(shù)細(xì)胞，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比。 MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及對(duì)化療藥物的敏感性 SKBR-3乳腺癌細(xì)胞株以5×103/孔接種細(xì)胞至96孔板上，細(xì)胞轉(zhuǎn)染72h之后加MTT孵育4h，酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度。以pU6轉(zhuǎn)染組為空白對(duì)照組，計(jì)算各轉(zhuǎn)染組相對(duì)空白對(duì)照組的百分

9、比，測(cè)定細(xì)胞活力。 同上述方法相同，轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，將不同濃度表阿霉素加入各組細(xì)胞，48小時(shí)后測(cè)試細(xì)胞活力。 HER-2陽(yáng)性動(dòng)物模型及原位乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型的建立 4-6周齡雌性裸小鼠，在第二對(duì)乳房墊原位種植5×106個(gè)SKBR-3細(xì)胞，形成腫瘤后再將腫瘤移植到裸鼠第二對(duì)乳房墊，放在SPF環(huán)境中飼養(yǎng)，形成原位HER-2陽(yáng)性乳腺癌模型。 原位肝轉(zhuǎn)移模型的建立在正常環(huán)境下進(jìn)行。在SKBR-3細(xì)胞在體內(nèi)形成腫瘤后

10、，取腫瘤種植在裸鼠原位，等到裸鼠腫瘤長(zhǎng)成后，取其中一只再進(jìn)行裸鼠腫瘤原位移植，觀察裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)情況及肝肺轉(zhuǎn)移情況。 載體介導(dǎo)的RNA干擾藥物傳遞及觀察 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照空白對(duì)照，陰性對(duì)照及治療分為三組?？瞻捉M無(wú)任何處理，陰性對(duì)照注射GFPshRNA，治療組注射HER-2shRNA；將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染藥物同載體介導(dǎo)的RNA干擾藥物混合，在體外孵育20分鐘后，按照腫瘤體積大小分別將其注射到正常環(huán)境及SPF環(huán)境下的動(dòng)物模型腫瘤內(nèi)，每周

11、觀察腫瘤大小及動(dòng)物生存狀態(tài)。 結(jié)果重組質(zhì)粒的篩選和鑒定 HER-2-shRNA表達(dá)載體重組構(gòu)建成功，酶切初步篩選后，測(cè)序鑒定序列完全正確。 半定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后mRNA水平HER-2基因表達(dá)的影響 HER-2-shRNApU6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SKBR-3細(xì)胞72h后，HER-2mRNA水平較對(duì)照組有明顯下降(下降約60％左右)；GFP-shRNApU6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的HER-2mRNA水平較對(duì)照組無(wú)明

12、顯變化。 Wenten-Blot及免疫組化分析細(xì)胞轉(zhuǎn)染后HER-2蛋白表達(dá)的情況 細(xì)胞轉(zhuǎn)染72h后，提取各處理組細(xì)胞蛋白，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和Westernblot檢測(cè)，成像后進(jìn)行圖像分析，分析結(jié)果顯示HER-2-shRNApU6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的HER-2蛋白水平較對(duì)照組下降55％左右；GFP-shRNApU6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的HER-2蛋白水平無(wú)明顯變化。 HER-2免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)HER-2sh

13、RNApU6轉(zhuǎn)染后，HER-2在細(xì)胞膜上的表達(dá)明顯降低，而兩個(gè)對(duì)照組沒(méi)有明顯變化。 HER-2基因干擾對(duì)SKBR-3細(xì)胞周期分布的影響及凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：HER-2-shRNA轉(zhuǎn)染組的G0/G1期細(xì)胞比例較對(duì)照組增加約9％左右，并且凋亡細(xì)胞比率增加；而GFP-shRNA轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組G0/G1期細(xì)胞比例、凋亡細(xì)胞比率幾乎沒(méi)有明顯差別。 SKBR-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，用TUNEL法分細(xì)胞凋亡，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)

14、胞數(shù)，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比。結(jié)果為：HER-2-shRNApU6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組凋亡細(xì)胞百分比較對(duì)照組增加6.3％；GFP-shRNApU6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組間無(wú)明顯差異。 MTT法檢測(cè)HER-2基因干擾對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及對(duì)化療敏感性的影響 HER-2-shRNApU6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染抑制HER-2/neu基因表達(dá)能明顯抑制SKBR-3細(xì)胞生長(zhǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，HER-2-shRNAPu6轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長(zhǎng)分布不均，成片狀。MTT結(jié)果顯示該組細(xì)胞

15、生長(zhǎng)活力明顯減弱(P＜0.05)。 HER-2-shRNApU6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染提高了SKBR-3細(xì)胞對(duì)化療藥物表阿霉素的敏感性，相比對(duì)照組，腫瘤細(xì)胞對(duì)表阿霉素的敏感性增加了10多倍。 HER-2陽(yáng)性原位乳腺癌模型及原位乳腺癌肝轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)模型的建立 所有在SPF環(huán)境或者非SPF環(huán)境下的原位HER-2陽(yáng)性腫瘤模型都獲得成功，在非SPF環(huán)境下沒(méi)有出現(xiàn)明顯的并發(fā)癥及動(dòng)物死亡。 經(jīng)過(guò)3次體內(nèi)篩選，正常飼養(yǎng)環(huán)境下，腫瘤的惡性度出

16、現(xiàn)增加，腫瘤出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移的頻率明顯增高，達(dá)到81％，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的肺轉(zhuǎn)移。 體內(nèi)HER-2shRNA抑制HER-2陽(yáng)性乳腺腫瘤的生長(zhǎng) 經(jīng)過(guò)10周觀察，沒(méi)有動(dòng)物出現(xiàn)非腫瘤性死亡。在10周時(shí)，腫瘤的大小在HER-2shRNA比兩個(gè)對(duì)照組明顯要小，分別為3661.99±825.65mm3及3776.30±675.65mm3，1927.56±425.09mm3(p＜0.05)；抑制效果在腫瘤較小的時(shí)候更明顯，尤其是當(dāng)腫瘤直徑小于0

17、.5cm時(shí)。 結(jié)論1.表達(dá)HER-2-shRNA的重組psilencer1.0-U6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，明顯地抑制乳腺癌SKBR-3細(xì)胞HER-2mRNA和蛋白的表達(dá)水平。 2.HER-2-shRNApU6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，HER-2基因干擾可以抑制乳腺癌細(xì)胞SKBR-3的生長(zhǎng)，并引起細(xì)胞阻滯在G0/G1期。 3.HER-2-shRNApU6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，HER-2基因干擾可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞SKBR-3凋亡。 4.HER-2