結(jié)核分枝桿菌反式翻譯過程關(guān)鍵蛋白SmpB的生化性質(zhì)和溶液結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、反式翻譯是結(jié)核分枝桿菌體內(nèi)唯一的核糖體拯救機(jī)制，與細(xì)菌生存和繁殖密切相關(guān)。SmpB蛋白是反式翻譯核心分子tmRNA的重要伴侶分子，它可以與tmRNA特異性結(jié)合，并與tmRNA活性的發(fā)揮密切相關(guān)，可作為高通量篩選新型抗結(jié)核藥物的潛在靶點(diǎn)。因此，研究結(jié)核分枝桿菌反式翻譯過程中的SmpB蛋白(MtSmpB)的三維結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)特征，對(duì)設(shè)計(jì)和研發(fā)新型抗結(jié)核藥物有著重要的研究意義。
　　本論文，我們首先利用基因克隆技術(shù)，構(gòu)建了含有不同片段長度

2、的MtSmpB基因的重組子，經(jīng)過大量的表達(dá)純化條件篩選和優(yōu)化，最終成功制備了MtSmpB（10-154）蛋白及其N-terminal結(jié)構(gòu)域(MtSmpBNTD)蛋白。遠(yuǎn)紫外CD光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MtSmpB蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-sheet為主，全長的MtSmpB與MtSmpBNTD相比無歸卷曲含量明顯增加，推測(cè)MtSmpB羧基端在溶液中可能以無規(guī)卷曲的構(gòu)象存在，與文獻(xiàn)報(bào)道的大腸桿菌和嗜熱菌SmpB蛋白的N-terminal結(jié)構(gòu)相類似。我們還

3、利用圓二色譜實(shí)驗(yàn)對(duì)MtSmpBNTD二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究:尿素誘導(dǎo)的去折疊過程表明MtSmpBNTD蛋白在尿素溶液中的Gm值為3.015±0.133M，在低濃度變性劑存在時(shí)二級(jí)結(jié)構(gòu)就會(huì)發(fā)生明顯改變;熱誘導(dǎo)的去折疊過程表明其Tm值為76.540±0.013℃，溫度高于70℃時(shí)二級(jí)結(jié)構(gòu)才會(huì)發(fā)生去折疊。
　　此外，我們制備了15N和13C雙標(biāo)記的MtSmpBNTD蛋白樣品，并在Bruker AvanceⅢ850MHz核磁譜儀上采集

4、了一系列的2D和3D NMR譜，用于MtSmpBNTD蛋白的主鏈和側(cè)鏈原子的化學(xué)位移指認(rèn)和結(jié)構(gòu)計(jì)算。利用Sparky軟件我們已經(jīng)完成了95％的主鏈氨基酸序列認(rèn)證和85％以上的側(cè)鏈原子化學(xué)位移指認(rèn)。用CSI法預(yù)測(cè)該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-折疊為主，與CD實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。由于一些氨基酸殘基化學(xué)位移的簡(jiǎn)并，增加了譜峰指認(rèn)的難度，影響了結(jié)構(gòu)計(jì)算的進(jìn)度，但是初步計(jì)算結(jié)果表明MtSmpBNTD蛋白折疊正確。下一步我們將參考同源模建的三維結(jié)構(gòu)完成MtSmpB