結核分枝桿菌Esx-1分泌系統(tǒng)相關蛋白EspL、EspG1的生化性質和功能的研究.pdf

1、由巨噬細胞等人體免疫細胞聚集形成的肉芽腫是結核病的形成標志，肉芽腫的形成在結核分枝桿菌的致病過程中扮演著重要角色，它使被感染的宿主與結核分枝桿菌融合在一起。結核分枝桿菌通過特異性的蛋白分泌系統(tǒng)Esx-1分泌系統(tǒng)將具有毒性作用的毒力因子通過高疏水性的細胞膜分泌到胞外。這些毒力因子與宿主中肉芽腫的形成以及結核分枝桿菌毒性作用有關。EspL是結核分枝桿菌Esx-1分泌系統(tǒng)中的一個重要的蛋白，已有研究表明EspL可能通過影響另外兩個毒力因子Es

2、pE和ESAT-6的分泌而調控肉芽腫的形成。但是EspL的結構與功能以及調控肉芽腫的形成分子機制尚未清楚。
　　結構生物學是測定生物大分子空間結構和分子間相互作用的強有力的技術手段。解析Esx-1分泌系統(tǒng)中重要蛋白的三維結構，并闡明這些蛋白之間的相互作用及其機制，將有助于人們更好地理解Esx-1分泌系統(tǒng)發(fā)揮功能的結構基礎和分子機制，并為結核病的預防和診斷及抗結核病藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。鑒于結核分枝桿菌EspL（MtEspL）蛋白

3、的結構和功能尚不清楚。本論文著重研究MtEspL蛋白的表達純化和功能。我們摸索并優(yōu)化了大量MtEspL重組子表達純化條件，最終成功地制備出大量的、高純度的、構象均一的、穩(wěn)定的MtEspL蛋白樣品。MtEspL在大腸桿菌的產(chǎn)率是14 mg/L，蛋白的純度為98％。然后，我們用多種生物物理技術對MtEspL蛋白進行了理化性質表征。動態(tài)光散射實驗表明MtEspL以二聚體形式存在;遠紫外CD光譜實驗表明MtEspL的二級結構主要以α螺旋為主;脲

4、變性實驗表明MtEspL結構的穩(wěn)定性相對較差;1H-15N HSQC實驗表明MtEspL在溶液中以對稱二聚體存在，結構折疊良好，意味著有可能通過生物NMR技術解析MtEspL的三維結構;熒光實驗表明MtEspL與DNA有中等偏強的相互作用。我們的研究結果為下一步解析MtEspL的三維結構和深入闡明MtEspL的功能奠定了基礎。
　　EspG1是結核分枝桿菌中Esx-1分泌系統(tǒng)中另外一個重要的蛋白(MtEspG1)，作為分子伴侶蛋白

5、，它能夠特異性地識別并結合Esx-1分泌系統(tǒng)中的PE/PPE蛋白，將PE/PPE蛋白引導到分泌通道，通過分泌通道分泌到細菌體外。這些PE/PPE蛋白被鑲嵌在細菌表面，或者分泌到被感染的宿主體內，發(fā)揮毒性作用。因此，MtEspG1在結合分枝桿菌中具有重要的生理功能，缺失MtEspG1將減弱結核分枝桿菌的毒性。MtEspG1的低同源蛋白MtEspG5的三維結構已被解析了，但是MtEspG1的三維結構尚未報道，可能是緣于制備MtEspG1蛋白