不同途徑移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠功能恢復(fù)和神經(jīng)再生的研究.pdf

1、目的:利用Marmarou大鼠中度創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)模型，(1)探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是否可以向TBI損傷灶中遷移、存活，并促進(jìn)TBI大鼠的神經(jīng)功能功能恢復(fù);(2)探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)TBI大鼠治療作用的機(jī)制，包括分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、向神經(jīng)組織分化;(3)比較腦內(nèi)和靜脈兩種不同移植方法的治療效果有何不同。
　　 方法:1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:120只SPF級(jí)雌性SD大鼠(鼠齡為10周，重約280±20g)被隨機(jī)分配入

2、4組，包括假手術(shù)組（shamgroup，n=30）;腦創(chuàng)傷模型組(TBIgroup，n=30);腦內(nèi)移植組(intracerebraltreatmentgroup，n=30);靜脈移植組（intravenoustreatmentgroup，n=30）。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)自于SPF級(jí)雄性SD大鼠（鼠齡為3-4周），應(yīng)用貼壁篩選法分離SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，傳代、擴(kuò)增、純化，傳至第3代用于實(shí)驗(yàn)。
　　 2.模型制備和細(xì)胞移植:采用

3、改良Marmarou's法建立大鼠中度創(chuàng)傷性腦損傷2周、4周模型。腦內(nèi)移植組和靜脈移植組在傷后1天分別通過側(cè)腦室、尾靜脈注入約1×106個(gè)細(xì)胞，注入的液體量分別為10ul、0.5ml。
　　 3.檢測(cè)指標(biāo)和方法:分別從每組大鼠中隨機(jī)取出10只，在傷后1周、2周、3周、4周進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評(píng)分(mNSS)和轉(zhuǎn)棒儀測(cè)試。
　　 每組中的其余大鼠分別于傷后2周、4周處死，應(yīng)用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化;免疫組

4、織化學(xué)方法檢測(cè)腦組織神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的表達(dá)及分布情況;Westernblot法檢測(cè)腦組織神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的蛋白表達(dá)量的情況;激光共聚焦免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測(cè)性別決定基因(Sry)、微管相關(guān)蛋白2(MAP-2)和神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白（GFAP），觀察雄性大鼠BMSCs在雌性TBI大鼠腦組織內(nèi)的分布及向神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞的分化情況。
　　 4.定量測(cè)定及統(tǒng)計(jì)方法:免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞陽(yáng)性

5、度強(qiáng)弱用Image-ProPlus6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)半定量分析測(cè)定，以積分光度值(IOD)來(lái)表示。Westernblot蛋白定量分析用ImageJ圖像分析軟件分析測(cè)定，以目標(biāo)OD值與內(nèi)參OD值的比值來(lái)表示。實(shí)驗(yàn)中所得結(jié)果數(shù)據(jù)均用(x)±s表示，應(yīng)用SPSS13.0forwindows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，以單側(cè)P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:1.BMSCs的培養(yǎng)和鑒定:原代貼壁細(xì)胞以分散的集簇方式增

6、殖，大約10天后95％原代細(xì)胞融合，此時(shí)進(jìn)行傳代。傳代后細(xì)胞通過抑制期，生長(zhǎng)迅速，以后每次傳代需要4-5天，細(xì)胞形態(tài)變得更為均一，呈紡錘形，細(xì)胞簇呈平行排列生長(zhǎng)或漩渦狀生長(zhǎng)。傳到第3代的BMSCs被移植入大鼠體內(nèi)。通過細(xì)胞的生長(zhǎng)特性和形態(tài)鑒定其為BMSCs。
　　 2.形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果:HE染色光鏡下顯示假手術(shù)組皮層腦組織形態(tài)正常，血管管腔正常，管壁光滑，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量多，排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)正常;創(chuàng)傷模型組可見不同程度的蛛網(wǎng)膜

7、下腔出血，廣泛皮層腦組織水腫，血管腔擴(kuò)大，毛細(xì)血管充血，神經(jīng)元胞體腫脹，排列紊亂，甚至胞體縮小變形，核固縮濃染;與創(chuàng)傷模型組相比，腦內(nèi)移植組和靜脈移植組腦組織的病理改變均有不同程度的減輕。
　　 3.神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)結(jié)果:假手術(shù)組大鼠兩項(xiàng)神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)均表現(xiàn)正常;與假手術(shù)組相比，其余三組造模后所有相同時(shí)間點(diǎn)mNSS均升高，轉(zhuǎn)棒儀測(cè)試時(shí)間明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與創(chuàng)傷模型組相比，兩組BMSCs移植組大鼠在所有

8、相同時(shí)間點(diǎn)的mNSS均下降，轉(zhuǎn)棒儀測(cè)試時(shí)間均延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）;與靜脈移植組相比，腦內(nèi)移植組大鼠在2周、3周、4周時(shí)的mNSS較低，在第3周時(shí)，腦內(nèi)移植組比靜脈移植組轉(zhuǎn)棒儀測(cè)試時(shí)間延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 4.NGF免疫組化和Westernblot檢測(cè)結(jié)果:
　　 NGF免疫組化陽(yáng)性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，定位于胞漿中，陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，廣泛分布于檢測(cè)組織的大腦皮層中。在假手術(shù)組神經(jīng)

9、細(xì)胞的胞漿中僅呈弱陽(yáng)性表達(dá);其余三組大鼠造模后，在所有相同時(shí)間點(diǎn)所測(cè)陽(yáng)性結(jié)果與假手術(shù)組相比，免疫反應(yīng)增強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）;與創(chuàng)傷模型組相比，兩組BMSCs移植組大鼠在所有相同時(shí)間點(diǎn)所測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）;與靜脈移植組相比，腦內(nèi)移植組在所有相同時(shí)間點(diǎn)所測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均輕度增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 NGF為分子量32kD的蛋白。與NGF的

10、免疫組化檢測(cè)結(jié)果相似，假手術(shù)組僅有少量NGF表達(dá)，且蛋白表達(dá)量在兩時(shí)間點(diǎn)無(wú)變化;腦創(chuàng)傷模型組和兩組BMSCs移植組NGF動(dòng)態(tài)表達(dá)與免疫組織化學(xué)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果相吻合，比較同免疫組化檢測(cè)，差異同樣有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）;與靜脈移植組相比，腦內(nèi)移植組在所有相同時(shí)間點(diǎn)所測(cè)蛋白表達(dá)量均輕度增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 5.BDNF免疫組化和Westernblot檢測(cè)結(jié)果:
　　 BDNF免疫組化陽(yáng)性產(chǎn)

11、物和NGF相似，同樣為定位于細(xì)胞胞漿中的棕黃色顆粒，陽(yáng)性細(xì)胞呈圓形或橢圓形，廣泛分布于檢測(cè)組織的大腦皮層中。BDNF蛋白在假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞的胞漿中僅微量表達(dá)，免疫反應(yīng)性同樣不隨時(shí)間而發(fā)生變化;其余三組大鼠造模后，在所有相同時(shí)間點(diǎn)所測(cè)陽(yáng)性結(jié)果與假手術(shù)組相比，免疫反應(yīng)增強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與創(chuàng)傷模型組相比，兩組BMSCs移植組大鼠在所有相同時(shí)間點(diǎn)所測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05

12、）;與靜脈移植組相比，腦內(nèi)移植組僅在2周時(shí)所測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)輕度增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 BDNF為分子量27-34kD的蛋白。平均光密度分析發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組僅有微量BDNF表達(dá)，且蛋白表達(dá)量在兩時(shí)間點(diǎn)無(wú)變化;同樣，腦創(chuàng)傷模型組和兩組BMSCs移植組BDNF動(dòng)態(tài)表達(dá)與免疫組織化學(xué)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果相吻合，比較同免疫組化檢測(cè)，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）;不同于免疫組化檢測(cè)結(jié)果的是，與靜脈移植組的比較中，腦

13、內(nèi)移植組在所有相同時(shí)間點(diǎn)BDNF蛋白表達(dá)量均輕度增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 6.免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果
　　 Sry陽(yáng)性細(xì)胞胞核為FITC標(biāo)記的綠色熒光，MAP-2和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞胞漿為TRITC標(biāo)記的紅色熒光。假手術(shù)組和腦創(chuàng)傷模型組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未見綠染的或紅染的陽(yáng)性細(xì)胞;在兩細(xì)胞移植組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)大鼠腦切片中，均可見綠染的Sry與紅染的MAP-2共定位，及綠染的Sry與紅染的GFAP共定位;與同組2周

14、腦切片相比，腦內(nèi)移植組和靜脈移植組4周的腦切片中綠染的Sry陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少，仍可見與紅染的MAP2和GFAP共定位;腦內(nèi)移植組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)綠染的Sry陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯比靜脈移植組多;在腦內(nèi)移植組4周腦切片中，可看到單獨(dú)存在紅染的MAP2陽(yáng)性細(xì)胞，無(wú)綠染的Sry與其共定位;靜脈移植組4周腦切片可觀察到單獨(dú)存在紅染的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞，無(wú)綠染的Sry與其共定位;在靜脈移植組4周腦切片中，腦實(shí)質(zhì)和血管腔里仍可看到單獨(dú)綠染Sry而無(wú)分化紅染共定位的

15、BMSCs陽(yáng)性細(xì)胞。
　　 結(jié)論:1.通過側(cè)腦室和尾靜脈兩種途徑移植BMSCs治療大鼠創(chuàng)傷性腦損傷，BMSCs均可遷移入損傷灶內(nèi)，至少存活4周，可分化成為神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞，并促進(jìn)TBI大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)。
　　 2.BMSCs對(duì)TBI大鼠起治療作用的機(jī)制可能是:自分泌和旁分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子NGF、BDNF;自身分化成為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞;促進(jìn)內(nèi)源性前體細(xì)胞分化為神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞。
　　 3.從神經(jīng)功能恢復(fù)