不同途徑移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠腦缺血性損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過立體定向和尾靜脈途徑移植大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)到大腦中動(dòng)脈閉塞模型(MCAO)的大鼠腦內(nèi)，觀察MSCs移植對(duì)大鼠缺血性腦損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的作用并探討其作用機(jī)制和比較、篩選移植途徑。 方法：取體重150gSprague-Dawley大鼠長(zhǎng)骨的骨髓細(xì)胞，把MSCs分離出來(lái)傳代和擴(kuò)增，用FGF-2預(yù)誘導(dǎo)24小時(shí)，在細(xì)胞移植前24小時(shí)，在預(yù)誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的MSCs中摻入10mg/L的BrdU進(jìn)行標(biāo)記，用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

2、 用改良的ZeaLonga線拴法制作腦缺血再灌注模型，并采用大鼠的頭MRI檢查判斷腦缺血的部位和范圍。 將40只造模成功的SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組各8只。立體定向移植組(I、II)、尾靜脈移植組(III、IV)和對(duì)照組(V)，其中立體定向和尾靜脈組各包括移植預(yù)誘導(dǎo)MSCs和未誘導(dǎo)MSCs的兩組，對(duì)照組僅造模。立體定向移植組和尾靜脈移植組在造模1周后分別經(jīng)立體定向和尾靜脈途徑將標(biāo)記Brdu的MSCs(預(yù)誘導(dǎo)和未誘導(dǎo))懸液植

3、入腦缺血大鼠體內(nèi)，其中立體定向組將MSCs植入患側(cè)的紋狀體內(nèi)。然后進(jìn)行如下處理：①比較各組大鼠的不同移植時(shí)間(1d、2w、1m、2m、3m)的神經(jīng)功能評(píng)分(NSS)的差異②各組大鼠分別于移植后1m、2m、3m三個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死，灌注取腦，固定、包埋、切片。③以Brdu、NSE和GFAP作為增殖、分化的標(biāo)記物。免疫組化染色方法檢測(cè)Brdu陽(yáng)性細(xì)胞、Brdu+NSE與Brdu+GFAP的雙陽(yáng)性細(xì)胞。檢測(cè)各組大鼠的BDNF分泌水平。④探討不同途徑

4、移植的MSCs在腦缺血大鼠的腦內(nèi)的存活、遷移及分化情況，并探討機(jī)制。 結(jié)果：通過換液、傳代，MSCs被分離和純化，細(xì)胞形態(tài)為梭形，呈漩渦狀。流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD90的陽(yáng)性率為99％，CD34為0.3％，CD31為3.4％，證實(shí)了本試驗(yàn)分離培養(yǎng)的細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。用線栓法造MCAO模型后，大鼠表現(xiàn)為線栓動(dòng)脈對(duì)側(cè)的肢體癱瘓，頭MRI檢測(cè)證實(shí)造模成功。 移植后1d時(shí)各組的NSS評(píng)分達(dá)高峰，各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)，

5、在2w、1m、2m、3m時(shí)各移植組NSS評(píng)分均低于對(duì)照組(p<0.05)；在2w時(shí)尾靜脈組的NSS評(píng)分低于立體定向組(p<0.05)；1m時(shí)移植組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)：2m、3m時(shí)立體定向移植組的NSS評(píng)分低于尾靜脈組；2w、1m、3m時(shí)預(yù)誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)組NSS評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；2m時(shí)預(yù)誘導(dǎo)組NSS低于未誘導(dǎo)組(p<0.05)； 免疫組化染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植后1個(gè)月時(shí)各移植組均可見到Brdu+NSE、Brdu

6、+GFAP免疫組化雙染陽(yáng)性細(xì)胞，2個(gè)月時(shí)預(yù)誘導(dǎo)組的雙染陽(yáng)細(xì)胞多于未誘導(dǎo)組，3個(gè)月時(shí)各組間無(wú)明顯差異。立體定向組在梗死側(cè)半球的移植區(qū)有較多的Brdu陽(yáng)性細(xì)胞，多分布在針道的周圍，對(duì)側(cè)半球未見Brdu陽(yáng)性細(xì)胞。尾靜脈組見到雙側(cè)半球均可見Brdu陽(yáng)性細(xì)胞，梗死側(cè)多于對(duì)側(cè)。移植組的BDNF的分泌量明顯高于對(duì)照組，其中立體定向組又高于尾靜脈組(p<0.05)。 結(jié)論：MSCs可在體外分離、培養(yǎng)及傳代。 以立體定向和尾靜脈兩種途徑移