一株鵝呼腸孤病毒的分離鑒定及全基因組序列分析.pdf

1、近年來(lái)，江蘇地區(qū)許多鵝養(yǎng)殖場(chǎng)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一種感染雛鵝為主的以出血性壞死性肝炎為特征的病毒性傳染病。我們以發(fā)病鵝場(chǎng)采集患病鵝的實(shí)質(zhì)性器官為病料，通過(guò)接種SPF雞胚進(jìn)行病毒的分離，并結(jié)合臨床癥狀和病理變化，通過(guò)PCR、RT-PCR等分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)病毒進(jìn)行鑒定，確定為鵝呼腸孤病毒。暫時(shí)將本分離株命名為GRV JS2012。
　　為了確定該病毒的分類(lèi)學(xué)地位，我們通過(guò)有機(jī)溶劑敏感試驗(yàn)，溫度敏感試驗(yàn)，血凝試驗(yàn)等證明該病毒為RNA病毒、不具有雞血

2、紅細(xì)胞凝集特性，病毒對(duì)酸及氯仿不敏感，對(duì)胰蛋白酶敏感，對(duì)熱有一定的抵抗力。然后將病毒液進(jìn)行氯仿抽提、超高速差速離心及蔗糖密度梯度處理來(lái)純化病毒，經(jīng)磷酸鎢負(fù)染色進(jìn)行電鏡觀(guān)察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該病毒顆粒無(wú)囊膜、近似球形、直徑約為80nm，具有雙層衣殼結(jié)構(gòu)，每層均為20面體對(duì)稱(chēng)，具有典型的呼腸孤病毒屬特性。
　　我們將病毒液通過(guò)絨毛尿囊膜接種9-11日齡的SPF雞胚，連續(xù)觀(guān)察2-6天，收集死亡雞胚尿囊液及尿囊膜，依次接種至第3代。用第3代的尿囊

3、液、胚體及絨毛尿囊膜測(cè)定ELD50。結(jié)果測(cè)得尿囊液的ELD50為10-5.633/0.2mL，胚體及絨毛尿囊膜對(duì)雞胚的ELD50為10-5.83/0.2mL，表明胚體與絨毛尿囊膜的含毒量高于尿囊液。并將傳代后的病毒尿囊液用于雞胚成纖維細(xì)胞適應(yīng)性試驗(yàn)，在原代雞胚成纖維細(xì)胞上盲傳5代，測(cè)定其TCID50，結(jié)果表明該毒株病毒對(duì)CEF的TCID50為10-5.75/0.1mL。此外，動(dòng)物致病性試驗(yàn)表明，本分離株可以致死1日齡雛鵝，死亡率為100

4、％，而對(duì)于青年鵝及中年鵝不致病。
　　然后，我們依據(jù)NCBI已經(jīng)發(fā)表的鵝呼腸孤病毒的基因序列，設(shè)計(jì)了3段引物。采用RT-PCR方法擴(kuò)增得到3段目的片段，并對(duì)其序列進(jìn)行測(cè)定分析，結(jié)果表明與已經(jīng)發(fā)表的鴨呼腸孤病毒和鵝呼腸孤病毒親緣性較近，通過(guò)單個(gè)基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，本分離株與參考株03G株、J18株同源性高達(dá)80％-90％，與標(biāo)準(zhǔn)株S1133同源性較低。由此可知，本分離株應(yīng)該歸屬于禽正呼腸孤病毒屬不同于雞呼腸孤病毒分支的水禽呼腸

5、孤病毒分支。
　　最后，為了進(jìn)一步了解本分離株與ARV、DRV及GRV之間的進(jìn)化關(guān)系，我們對(duì)其進(jìn)行全基因組序列分析。根據(jù)已發(fā)表的基因序列設(shè)計(jì)了13對(duì)引物，采用RT-PCR方法擴(kuò)增得到目的片段，送至測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行整理，分析其開(kāi)放閱讀框的大小及數(shù)目，并與呼腸孤病毒屬的其他成員對(duì)比，繪制成基因進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明GRV JS2012株病毒全長(zhǎng)23，418bp，可分為大小不同的10個(gè)片段，組成病毒的10個(gè)片段大小如下:S1，1568bp

6、;S2,1326bp;S3,1202bp;S4,1191bp;M1,2283bp; M2,2158bp;M3,1996bp;L1,3958bp;L2，3829bp;L3，3907bp。與ARV其他毒株不同的是，GRV JS2012的σC蛋白由S1基因編碼，而ARV的σC由S4編碼。本分離株與ARV其他毒株一樣其5'端和3'端都存在保守序列，分別是5'-GCUUUU，3'-UCAUC。同源性分析表明GRV JS2012毒株與GRV03G株

7、相比，其核苷酸同源性高達(dá)89.7％-99.1％。與鴨源呼腸孤病毒DRV J18基因序列的同源性達(dá)20.4％-96.9％，其中以L(fǎng)1、L2、M1及S2的基因變異性較大;與雞源呼腸孤病毒ARV S1133株基因序列同源性達(dá)20.8％-77.0％。由此，我們認(rèn)為應(yīng)該將GRVJS2012歸屬于水禽呼腸孤病毒屬，而與雞呼腸孤病毒不同屬。基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，本分離株與鵝源呼腸孤病毒同屬一支，而與鴨呼腸孤病毒存在一定的差異，與雞呼腸孤病毒處在不同