一株鵝呼腸孤病毒的分離鑒定及全基因組序列分析.pdf

1、近年來，江蘇地區(qū)許多鵝養(yǎng)殖場陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一種感染雛鵝為主的以出血性壞死性肝炎為特征的病毒性傳染病。我們以發(fā)病鵝場采集患病鵝的實質性器官為病料，通過接種SPF雞胚進行病毒的分離，并結合臨床癥狀和病理變化，通過PCR、RT-PCR等分子生物學技術對病毒進行鑒定，確定為鵝呼腸孤病毒。暫時將本分離株命名為GRV JS2012。
　　為了確定該病毒的分類學地位，我們通過有機溶劑敏感試驗，溫度敏感試驗，血凝試驗等證明該病毒為RNA病毒、不具有雞血

2、紅細胞凝集特性，病毒對酸及氯仿不敏感，對胰蛋白酶敏感，對熱有一定的抵抗力。然后將病毒液進行氯仿抽提、超高速差速離心及蔗糖密度梯度處理來純化病毒，經(jīng)磷酸鎢負染色進行電鏡觀察，結果發(fā)現(xiàn)該病毒顆粒無囊膜、近似球形、直徑約為80nm，具有雙層衣殼結構，每層均為20面體對稱，具有典型的呼腸孤病毒屬特性。
　　我們將病毒液通過絨毛尿囊膜接種9-11日齡的SPF雞胚，連續(xù)觀察2-6天，收集死亡雞胚尿囊液及尿囊膜，依次接種至第3代。用第3代的尿囊

3、液、胚體及絨毛尿囊膜測定ELD50。結果測得尿囊液的ELD50為10-5.633/0.2mL，胚體及絨毛尿囊膜對雞胚的ELD50為10-5.83/0.2mL，表明胚體與絨毛尿囊膜的含毒量高于尿囊液。并將傳代后的病毒尿囊液用于雞胚成纖維細胞適應性試驗，在原代雞胚成纖維細胞上盲傳5代，測定其TCID50，結果表明該毒株病毒對CEF的TCID50為10-5.75/0.1mL。此外，動物致病性試驗表明，本分離株可以致死1日齡雛鵝，死亡率為100

4、％，而對于青年鵝及中年鵝不致病。
　　然后，我們依據(jù)NCBI已經(jīng)發(fā)表的鵝呼腸孤病毒的基因序列，設計了3段引物。采用RT-PCR方法擴增得到3段目的片段，并對其序列進行測定分析，結果表明與已經(jīng)發(fā)表的鴨呼腸孤病毒和鵝呼腸孤病毒親緣性較近，通過單個基因的系統(tǒng)進化樹分析顯示，本分離株與參考株03G株、J18株同源性高達80％-90％，與標準株S1133同源性較低。由此可知，本分離株應該歸屬于禽正呼腸孤病毒屬不同于雞呼腸孤病毒分支的水禽呼腸

5、孤病毒分支。
　　最后，為了進一步了解本分離株與ARV、DRV及GRV之間的進化關系，我們對其進行全基因組序列分析。根據(jù)已發(fā)表的基因序列設計了13對引物，采用RT-PCR方法擴增得到目的片段，送至測序，對測序結果進行整理，分析其開放閱讀框的大小及數(shù)目，并與呼腸孤病毒屬的其他成員對比，繪制成基因進化樹。結果表明GRV JS2012株病毒全長23，418bp，可分為大小不同的10個片段，組成病毒的10個片段大小如下:S1，1568bp

6、;S2,1326bp;S3,1202bp;S4,1191bp;M1,2283bp; M2,2158bp;M3,1996bp;L1,3958bp;L2，3829bp;L3，3907bp。與ARV其他毒株不同的是，GRV JS2012的σC蛋白由S1基因編碼，而ARV的σC由S4編碼。本分離株與ARV其他毒株一樣其5'端和3'端都存在保守序列，分別是5'-GCUUUU，3'-UCAUC。同源性分析表明GRV JS2012毒株與GRV03G株

7、相比，其核苷酸同源性高達89.7％-99.1％。與鴨源呼腸孤病毒DRV J18基因序列的同源性達20.4％-96.9％，其中以L1、L2、M1及S2的基因變異性較大;與雞源呼腸孤病毒ARV S1133株基因序列同源性達20.8％-77.0％。由此，我們認為應該將GRVJS2012歸屬于水禽呼腸孤病毒屬，而與雞呼腸孤病毒不同屬?；蛳到y(tǒng)進化樹分析表明，本分離株與鵝源呼腸孤病毒同屬一支，而與鴨呼腸孤病毒存在一定的差異，與雞呼腸孤病毒處在不同