RNA干擾抑制草魚呼腸孤病毒復制的細胞模型.pdf

1、草魚（Ctenopharyngodon idellus）是我國重要的淡水養(yǎng)殖對象。草魚出血病是草魚最為嚴重的疾病之一，死亡率高達90％，造成重大的經濟損失。目前對該病尚缺乏有效的防治方法。
　　 RNA干擾（RNAinterference,RNAi）是指小的RNA干擾分子(Small interferingRNA,siRNA)特異性地抑制同源基因的表達，它是廣泛存在于生物中的一種基因沉默現(xiàn)象。由于RNAi具有高度特異性和高效性，

2、可以作為抑制特定基因表達的工具。
　　 本研究利用RNAi技術，在草魚腎臟細胞系(Ctenopharyngodon idellus Kidney,CIK)上建立抑制草魚呼腸孤病毒(Grass Carp Reovirus, GCRV)復制的模型，以期為定向抗病毒草魚分子育種技術研究奠定前期基礎。本論文主要進行了以下幾個方面的研究：
　　 1.在CIK細胞上大量增殖GCRV病毒，提取病毒的核酸，反轉錄得到cDNA,以cDNA

3、為模板進行PCR，擴增產物連接到T載體，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，提取質粒進行PCR鑒定，將陽性克隆測序，得到GCRV的部分基因片段序列。
　　 2.采用化學合成法分別合成靶向草魚呼腸孤病毒RNA分段基因組L2片段上的RNA聚合酶基因(RdRp)和S10片段上的外衣殼蛋白基因(OCP)的小干涉RNA分子siRNA-RdRp1286、siRNA-RdRp1441和siRNA-OCP117。用Lipofectamine2000轉染CI

4、K細胞。轉染6h后用GCRV感染細胞，48h后收集感染細胞的培養(yǎng)液，測定病毒TCID50/0.1mL值。Trizol試劑盒提取感染細胞的總RNA，以細胞管家基因β-actin mRNA水平為參照，采用RT-PCR檢測呼腸孤病毒siRNAs靶基因的mRNA水平。病毒滴度測定結果表明：轉染siRNA-RdRp1286、siRNA-RdRp1441和siRNA-OCP117后細胞培養(yǎng)液的病毒滴度分別為104.41±0.16、103.83±0.

5、44和101.94±0.42,極顯著低于病毒感染陽性對照組的病毒滴度（107.92±0.52,p＜0.01），轉染siRNA陰性對照組的病毒滴度為107.50土0.17，與病毒感染陽性對照相比，差異不顯著(p＞0.05)。RT-PCR檢測結果顯示：與病毒感染陽性對照相比，轉染siRNA-RdRp1286、siRNA-RdRp1441和siRNA-OCP117后的CIK細胞中GCRV mRNA水平顯著下降(p＜0.01)，抑制率分別為82

6、.08±2.15％、89.19±1.14％、92.96±0.17％，而轉染siRNA陰性對照對GVRVmRNA的水平沒有顯著的影響(p＞0.05)。結論：針對RNA聚合酶基因和外衣殼蛋白基因設計并化學合成的siRNA特異、高效地抑制了草魚呼腸孤病毒的復制。
　　 3.針對GCRV RNA聚合酶基因和外衣殼蛋白基因的3個位點，設計并合成了長度為63bp、5’端磷酸化用于質粒表達的3段含siRNA特異序列的寡聚脫氧核糖核苷酸正鏈和負