MicroRNA-10b靶向CDH1促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的初步研究.pdf

1、第一部分：目的：研究乳腺癌組織及正常乳腺組織中miR-10b、CDH1mRNA以及上皮鈣黏蛋白(E-cadherin，E-cad)的表達(dá)及其臨床意義，分析miR-10b與CDH1mRNA以及E-cad之間的相互關(guān)系。
　　 方法：采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(FQ-RT-PCR)方法分別檢測(cè)16例正常乳腺組織、21例原發(fā)性乳腺癌組織及23例轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中miR-10b 及CDH1mRNA的表達(dá)水平；使用Western blo

2、t 方法檢測(cè)三種組織中E-cad 蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：1.原發(fā)性乳腺癌組織與正常乳腺組織相比，miR-10b基因表達(dá)輕度下降約18.8％（p=0.132）；轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織與正常乳腺組織及原發(fā)性乳腺癌組織相比miR-10b基因表達(dá)明顯升高分別達(dá)5.0 倍及6.1 倍（p=0.015）。2.原發(fā)性乳腺癌組織與正常乳腺組織相比，CDH1mRNA表達(dá)輕度升高約11.5％（p=0.270）；轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織與正常乳腺組織及原發(fā)

3、性乳腺癌組織相比CDH1mRNA表達(dá)顯著下降分別達(dá)4.6 倍及5.1 倍（p=0.021）。3.原發(fā)性乳腺癌組織與正常乳腺組織相比，E-cad表達(dá)輕度升高約20％（p=0.386）；轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織與正常乳腺組織及原發(fā)性乳腺癌組織相比E-cad表達(dá)顯著下調(diào)分別達(dá)5.2 倍及6.3 倍（p=0.007）。4.miR-10b的表達(dá)水平與乳腺癌組織的腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、人表皮生長(zhǎng)因子受體2（Humanepidermal grow

4、th factor receptor-2，Her-2）狀態(tài)、增殖細(xì)胞核抗原Ki-67 數(shù)值及臨床分期呈正相關(guān)性，與雌激素受體（Estrogen receptor，ER）及孕激素受體（Progesteronereceptor，PR）狀態(tài)呈負(fù)相關(guān)性（p＜0.05），而與腫瘤組織學(xué)類(lèi)型及患者年齡無(wú)關(guān)（p>0.05）。5.乳腺癌中miR-10b表達(dá)與CDH1mRNA和E-cadherin 蛋白表達(dá)之間存在相關(guān)性。
　　 結(jié)論：1.miR

5、-10b在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中的表達(dá)水平顯著升高，CDH1mRNA 及E-cad表達(dá)水平顯著降低，miR-10b與CDH1mRNA 及E-cad 之間存在顯著負(fù)相關(guān)。2.miR-10b可能通過(guò)靶向調(diào)控CDH1mRNA的表達(dá)發(fā)揮促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用。3.miR-10b與乳腺癌的臨床不良預(yù)后因素存在密切聯(lián)系，miR-10b 可以作為乳腺癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后判斷的預(yù)測(cè)因子。
　　 第二部分：目的：分析下調(diào)miR-10b后CDH1mRNA與E-cad

6、表達(dá)水平的變化以及對(duì)MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響，探討miR-10b在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用及其通路。
　　 方法：通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)miR-10b 抑制劑(inhibitor)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察瞬時(shí)轉(zhuǎn)染情況。轉(zhuǎn)染后48 小時(shí)，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR（FQ-RT-PCR）方法檢測(cè)MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞中miR-10b 及CDH1mRNA基因的表達(dá)，Western

7、 blot 技術(shù)用于檢測(cè)MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞中上皮鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）的表達(dá)情況。設(shè)轉(zhuǎn)染試劑組（Mock組）為對(duì)照。采用transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染miR-10b inhibitor后MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的變化。
　　 結(jié)果：1.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染4-6 小時(shí)后即可觀察到羥基熒光素基團(tuán)發(fā)出的綠色熒光。2.轉(zhuǎn)染inhibitor MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞中miR-10b的表

8、達(dá)顯著降低（p=0.010），CDH1mRNA的表達(dá)明顯增加（p=0.009），E-cad 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高（p=0.037）。3.miR-10b表達(dá)降低后轉(zhuǎn)染miR-10b inhibitor組透膜細(xì)胞數(shù)目顯著下降（p=0.033）。
　　 結(jié)論：1.下調(diào)miR-10b 可使CDH1mRNA 及E-cad 蛋白表達(dá)明顯升高，并顯著降低MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力。2.本細(xì)胞功能研究初步驗(yàn)證了乳腺癌中存在mi

9、R-10b/CDH1mRNA 促轉(zhuǎn)移通路。
　　 第三部分：目的：分析過(guò)表達(dá)miR-10b后CDH1mRNA與E-cad表達(dá)水平的變化以及對(duì)MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響，探討miR-10b在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用及其通路。
　　 方法：通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)體內(nèi)成熟的miR-10b模擬物 (mimics)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察瞬時(shí)轉(zhuǎn)染情況。轉(zhuǎn)染后24 及48 小時(shí)，采用實(shí)時(shí)熒光

10、定量RT-PCR（FQ-RT-PCR）方法檢測(cè)MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞中miR-10b 及CDH1mRNA基因的表達(dá)，Western blot 技術(shù)用于檢測(cè)MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞中上皮鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）的表達(dá)情況。設(shè)轉(zhuǎn)染試劑組（Mock組）為對(duì)照。采用transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染miR-10b mimics后MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的變化。
　　 結(jié)果：1.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

11、4-6 小時(shí)后即可觀察到羥基熒光素基團(tuán)發(fā)出的綠色熒光。2.
　　 轉(zhuǎn)染mimics MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞中miR-10b的表達(dá)顯著升高（p=0.001），CDH1mRNA的表達(dá)顯著下降（p=0.002），E-cad表達(dá)量較對(duì)照組下降12.5倍（p=0.006）。3.miR-10b表達(dá)升高后轉(zhuǎn)染miR-10b mimics組透膜細(xì)胞數(shù)目顯著增加（p=0.018）。
　　 結(jié)論：1.過(guò)表達(dá)miR-10b 可使CD