MicroRNA-10b通過下調(diào)靶基因KLF4的表達促進人食管癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移.pdf

1、MicroRNAs是一類內(nèi)源性的非編碼RNA,其大小約21個核苷酸。在哺乳動物細胞中,microRNA通過堿基之間的不完全互補配對識別靶基因的mRNA,根據(jù)互補程度的不同,降解靶mRNA或抑制靶mRNA的翻譯。目前研究證明,miRNAs在細胞生長、分化和凋亡中起著非常重要的作用。最近研究顯示,microRNA可以作用于腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的多條信號通路,以此調(diào)節(jié)腫瘤的轉(zhuǎn)移。
　　 首先,通過實時定量RT-PCR實驗,分析了8種人食管鱗狀

2、細胞癌(ESCC)細胞系中的miR-10b表達水平,發(fā)現(xiàn)不同細胞內(nèi)miR-10b表達水平存在較大差異。接下來通過transwell實驗分析了以上8種細胞的侵襲遷移能力,經(jīng)統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)miR-10b表達水平的高低與細胞的侵襲遷移能力密切相關(guān)。為了檢測miR-10b是否影響人ESCC細胞的侵襲遷移能力,在KYSE140細胞中過表達和在EC9706細胞中敲降miR-10b。我們發(fā)現(xiàn)在KYSE140細胞中過表達miR-10b可以促進細胞的侵襲

3、遷移能力,在EC9706細胞中敲降miR-10b可以抑制細胞的侵襲能力,而并不影響細胞的遷移能力。
　　 接下來我們探索了mig-10b作用的分子機制。生物信息學軟件分析預測KLF4是miR-10b的靶基因。KLF4作為轉(zhuǎn)錄因子參與細胞周期調(diào)節(jié),細胞凋亡和分化；DNA損傷,血清饑餓和接觸抑制均可刺激KLF4表達增加。最近研究發(fā)現(xiàn),在人ESCC細胞系TE2細胞中,KLF4可以抑制細胞的侵襲和遷移。此外,in vivo實驗顯示KLF

4、4能夠抑制胰腺癌細胞轉(zhuǎn)移,在直腸癌細胞RKO細胞中過表達KLF4可以抑制細胞的侵襲遷移。我們分別構(gòu)建了含有KLF4 mRNA的全長3’UTR的報告基因質(zhì)粒和核心結(jié)合位點4個堿基突變的報告基因質(zhì)粒。通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?發(fā)現(xiàn)KLF4是miR-10b的直接靶基因。
　　 在KYSE140和KYSE450細胞中過表達miR-10b可以使內(nèi)源KLF4蛋白水平降低,在EC9706細胞中敲降miR-10b引起KLF4蛋白水平升高。而且

5、通過放線菌素D處理,測定miR-10b過表達時KLF4半衰期的改變,發(fā)現(xiàn)miR-10b對KLF4蛋白的半衰期并無影響。MiR-10b對KLF4表達水平的影響是通過轉(zhuǎn)錄后抑制途徑。
　　 然后,我們在KYSE140細胞和EC9706細胞中驗證了KLF4對細胞的侵襲遷移能力的影響。在KYSE140細胞中通過siRNA敲降KLF4促進細胞的侵襲和遷移,而在EC9706細胞中過表達KLF4下調(diào)細胞的侵襲遷移能力。說明KLF4對人類ESC

6、C細胞侵襲遷移能力的負調(diào)節(jié)作用。我們在KYSE140細胞中共表達miR-10b和KLF4,以及在EC9706細胞中同時敲降miR-10b和KLF4,均可以使miR-10b對細胞侵襲遷移能力的作用受到部分抑制。因此我們認為KLF4是miR-10b的直接和功能性靶基因。
　　 最后,通過實時定量RT-PCR分析40對人ESCC標本中miR-10b的表達水平,我們發(fā)現(xiàn)miR-10b在95％(38/40)的食管癌組織中高表達。但是在這些