實驗性糖尿病大鼠腎臟色素上皮衍生因子和轉(zhuǎn)化生長因子β-,1-的表達(dá)及羅格列酮的干預(yù)作用.pdf

1、目的： 糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)重要的慢性微血管并發(fā)癥之一，以腎小球基底膜增厚、系膜擴(kuò)張以及胞外基質(zhì)(ExtracellularMatrix，ECM)增生為病理特征，導(dǎo)致腎小球的高濾過和蛋白尿，是引起終末期腎衰的重要原因。腎小球?qū)嵸|(zhì)細(xì)胞，尤其是系膜細(xì)胞可分泌和表達(dá)多種細(xì)胞因子，其中轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth fact

2、or，F(xiàn)GF)-β<,1>和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是早期DN發(fā)生的關(guān)鍵因子。TGF-β<,1>是ECM的調(diào)節(jié)劑，其過度表達(dá)可導(dǎo)致ECM積聚；刺激足突細(xì)胞分泌VEGF。色素上皮衍生因子(pigmem epithelium-derived factor，PEDF)屬絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，最早由胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的培養(yǎng)液中分離出來，是最有效的新生血管抑制劑。PE

3、DF和VEGF的平衡表達(dá)是維持眼內(nèi)血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的重要因素。PEDF與體內(nèi)多個器官功能有關(guān)，最近國外一項研究顯示，DM大鼠腎臟的皮質(zhì)和髓質(zhì)中PEDF都顯著下降，腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng)顯示PEDF可顯著下調(diào)TGF-β<,1>的表達(dá)，可見其是一種與DN發(fā)生密切相關(guān)的因子。羅格列酮是噻唑烷二酮類(TZDs)藥物中的一種，它通過減輕胰島素抵抗，增強(qiáng)胰島素敏感性來降低血糖；改善腎小球高濾過狀態(tài)，調(diào)節(jié)系膜細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞增殖、分化，減少炎癥因子產(chǎn)生，

4、糾正脂代謝紊亂，從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。除上述作用外，它還有血管保護(hù)和抗炎作用。多項國內(nèi)外臨床及基礎(chǔ)實驗均顯示，TZDs可下調(diào)腎臟TGF-β<,1>水平，還可以減少VEGF的表達(dá)并呈劑量依賴性，這就是其抗炎和血管保護(hù)作用的具體體現(xiàn)。由于PEDF在DM大鼠腎臟的異常表達(dá)及其在眼部疾病中與VEGF的密切關(guān)系，還有最新發(fā)現(xiàn)的其抑制TGF-β<,1>表達(dá)的作用，推測羅格列酮可通過上調(diào)PEDF水平來抑制VEGF和TGF-β<,1>的表達(dá)，從而改善腎

5、小球高濾過狀態(tài)，減少ECM堆積，對DM大鼠的腎臟起到保護(hù)作用。因此，本研究通過腹腔一次性注射大劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)的方法，建立1型糖尿病大鼠模型，該模型與人類1型DM的病理過程和代謝特點相似，并給予干預(yù)組羅格列酮治療，在此基礎(chǔ)上觀察PEDF和TGF-β<,1>在正常大鼠與糖尿病大鼠腎臟表達(dá)的變化及羅格列酮的干預(yù)作用，從而進(jìn)一步研究糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制和羅格列酮對糖尿病的腎臟保護(hù)作用。 方法：

6、 1.選擇雄性SD大鼠42只，給予標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，從中隨機(jī)抽取14只作為正常對照組(NC組)，其余作為模型組(MO組)。后者給予腹腔一次性注射大劑量鏈脲佐菌素(STZ，55mg/kg)，破壞胰島β細(xì)胞，建立1型糖尿病模型。于注射STZ后72h，選擇空腹血糖(FBG)大于16.7mmol/L者作為1型糖尿病大鼠模型。再把成模大鼠隨機(jī)分為糖尿病對照組(DM組)、糖尿病羅格列酮干預(yù)組(RSG組)。RSG組于成模后第2天開始

7、給予羅格列酮鈉(5mg/kg.d)混懸液灌胃，另外兩組予以等體積生理鹽水灌胃。實驗全程共持續(xù)12周，于造模前、造模72小時及實驗結(jié)束前尾靜脈取血測空腹血糖(FBG)；實驗結(jié)束前測體重，并用代謝籠收集24小時尿液，放射免疫分析法測定24小時尿白蛋白排泄量(UAE)；于第12周末，股動脈放血處死動物，收集血液，測定血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白一膽固醇(LDL-C)、極低密度脂蛋白.膽固醇(VLDL-C)、肌酐(SCr

8、)、尿素氮(BUN)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)；酶聯(lián)免疫分析法測定血清PEDF的濃度；摘取雙側(cè)腎臟稱重，分別進(jìn)行病理學(xué)HE染色觀察腎臟形態(tài)學(xué)變化，免疫熒光染色觀察PEDF和TGF-β<,1>的表達(dá)部位及強(qiáng)度；免疫組化的方法檢測腎臟PEDF和TGF-β<,1>的蛋白表達(dá)情況及表達(dá)部位；Western印跡，分析PEDF和TGF-β1在糖尿病大鼠、羅格列酮干預(yù)組和正常大鼠腎臟皮質(zhì)的表達(dá)水平。 2.統(tǒng)計學(xué)分析：所有資料

9、以SPSS12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，首先用描述性統(tǒng)計和分析研究變量分布，符合正態(tài)分布的測定值以(x±s)表示，兩組間的比較采用t檢驗，多組間的比較采用方差分析。 結(jié)果： 1.DM組和RSG組大鼠造模72小時后，其FBG較NC組升高，差異有顯著性(P<0.01)。12周末，DM組和RSG組大鼠FBG較NC組升高，差異有顯著性(P<0.01)；但這兩組大鼠FBG相比較無顯著性差異(P=0.52)。 2.12周末實驗結(jié)

10、束時，DM組大鼠腎重、腎重/體重較NC組增加，差異具有顯著性(P<0.01，P<0.01)；RSG組腎重、腎重/體重較NC組增加，但較DM組降低，差異具有顯著性(P均<0.05)。 3.DM組大鼠12周末，血清TG、TC、LDL-C、BUN、SCr較NC組升高，差異具有顯著性(P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.01，P<0.01)；RSG組TG、TC、BUN、SCr較NC組升高，差異具有顯著性(P<0.05，P<

11、0.05，P<0.01，P<0.01)，但TG、BUN、SCr較DM組降低，差異具有顯著性(P<0.05，P<0.05，P<0.01)。 4.DM組大鼠12周后，24小時尿白蛋白排泄量(UAE)較NC組升高，差異具有顯著性(P<0.01)。RSG組尿白蛋白排泄量較NC組升高，較DM組降低，差異具有顯著性(P<0.01，P<0.05)。 5.血清PEDF的含量測定：DM組血清PEDF含量較NC組略有升高，差異無顯著性(P=

12、0.15)；RSG組較NC組和DM組略有降低，差異無顯著性(P=0.75，P=0.19)。 6.HE染色結(jié)果顯示，DM組多數(shù)腎小球明顯增大，腫脹，充血及腎小球肥大，基底膜增厚，腎小球系膜區(qū)增寬，少數(shù)腎小球出現(xiàn)輕度硬化；部分腎小管出現(xiàn)細(xì)胞空泡變性，管腔變窄。RSG組也有上述變化，但程度較DM組明顯減輕。 7.免疫組化結(jié)果顯示，DM組腎組織的PEDF表達(dá)較NC組降低，體現(xiàn)在陽性染色的(面密度×陽性單位)值均低于NC組，差異具

13、有顯著性(P<0.01)，其陽性染色主要分布在腎小球基底膜、小動脈壁、腎小管基底膜上；而RSG組的PEDF表達(dá)強(qiáng)度則介于DM組和NC組之間。DM組腎組織TGF-β<,1>的表達(dá)較NC組增加，體現(xiàn)在陽性染色的(面密度×陽性單位)值高于NC組，差異具有顯著性(P<0.01)，其陽性染色主要分布在腎小球基底膜和腎小管間質(zhì)；而RSG組的TGF-β<,1>表達(dá)強(qiáng)度則介于DM組和NC組之間。 8.免疫熒光結(jié)果顯示，DM組腎組織中PEDF的

14、表達(dá)較NC組有明顯的降低，體現(xiàn)在熒光強(qiáng)度明顯減弱，其熒光染色主要分布在腎小球基底膜、小動脈壁；而RSG組的PEDF表達(dá)強(qiáng)度則介于DM組和NC組之間。DM組腎組織中TGF-β<,1>的表達(dá)較NC組有明顯的增加，體現(xiàn)在熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，其熒光染色主要分布在腎小球基底膜和腎小管間質(zhì)；而RSG組的TGF-β<,1>表達(dá)強(qiáng)度則介于DM組和NC組之間。 9.Westem印跡顯示，DM組大鼠腎臟皮質(zhì)PEDF的蛋白表達(dá)較NC組降低，差異具有顯

15、著性(P<0.01)。RSG組PEDF的蛋白表達(dá)較DM組升高，差異具有顯著性(P<0.05)；但較NC組降低且差異具有顯著性(P<0.05)。DM組大鼠腎臟皮質(zhì)TGF-β<,1>的蛋白表達(dá)較NC組升高，差異具有顯著性(P<0.01)。RSG組TGF-β<,1>的蛋白表達(dá)較DM組降低，差異具有顯著性(P<0.05)；但較DM組升高且差異具有顯著性(P<0.01)。 結(jié)論： 1.雄性SD大鼠接受一次性大劑量鏈脲佐菌素腹腔注射

16、，破壞大部分胰島β細(xì)胞，胰島素分泌絕對不足，造成持續(xù)高血糖狀態(tài)，在高糖作用下發(fā)生腎臟損害，至此建立了1型糖尿病大鼠腎損害模型，此模型可用于研究糖尿病腎臟損害和干預(yù)因素對腎臟的直接作用。 2.DM組大鼠腎臟PEDF的蛋白表達(dá)明顯低于NC組，而TGF-β<,1>的蛋白表達(dá)則高于NC組，提示腎組織中PEDF及TGF-β<,1>表達(dá)的改變與DM腎臟病變密切相關(guān)，腎臟PEDF表達(dá)的降低可能在DN的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。 3．經(jīng)羅格