糖尿病腎病腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及羅格列酮對(duì)其干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本課題擬通過高糖刺激人類近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)生長(zhǎng)和實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病大鼠模型，用羅格列酮分別進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，觀察腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)、增殖狀況及腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)標(biāo)志蛋白表達(dá)情況。通過體內(nèi)、外兩部分實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示高糖這一病理因素在腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化過程中的作用和PPAR-γ激動(dòng)劑治療糖尿病腎病的分子機(jī)制，為探討糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制及糖尿病腎病的早期治療提供新的線索及理論依據(jù)。 方法：第一部分細(xì)胞實(shí)

2、驗(yàn)：采用HK-2細(xì)胞第3代細(xì)胞株，同步培養(yǎng)后分為5組：N組為正常對(duì)照組(含5.5mmol/L葡萄糖)，H組為高糖組(含25mmol/L葡萄糖)，M組為高滲對(duì)照組(含5.5mmol/L葡萄糖及19.5mmol/L甘露醇)，HR5組為高糖DMEM加低濃度羅格列酮組(H組加入5μmol/L RGZ)，HRlO組為高糖DMEM加高濃度羅格列酮組(H組加入10μmol/L RGZ)。采用MTT法測(cè)定HK-2細(xì)胞增殖；光鏡和電鏡分別觀察HK-2細(xì)胞

3、的基本結(jié)構(gòu)與超微結(jié)構(gòu)；RT-PCR法和Western blot法分別檢測(cè)HK-2細(xì)胞FSP1、α-SMA、E-cad的mRNA和蛋白表達(dá)；收集細(xì)胞上清液體用ELISA法檢測(cè)TGF-β1的濃度。 第二部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：選擇清潔級(jí)Wistar雄性大鼠18只，隨機(jī)分為3組：N組為正常大鼠對(duì)照組(n=6)，D組為糖尿病腎病大鼠模型組(n=6)，R組為糖尿病腎病大鼠羅格列酮(文迪雅)干預(yù)組(n=6)。采用雙縮脲法測(cè)定24小時(shí)尿蛋白定量；硝基酚

4、比色法測(cè)定尿NAG酶活性；全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)Scr及24小時(shí)Ucr。取腎組織切片后行HE和MASSON染色；免疫組化法檢測(cè)FSP1、α-SMA、Col Ⅰ、CK-18表達(dá)；RT-PCR法檢測(cè)FSP1、α-SMA、CK-18的mRNA表達(dá)。 結(jié)果：第一部分細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：①與N組比較，H組：HK-2細(xì)胞呈梭形變，電鏡下粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯增加，線粒體及微絨毛明顯減少，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)肌微絲樣結(jié)構(gòu)；FSP1、a-SMA mRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P

5、<0.01)，E-cadmRNA和蛋白表達(dá)減弱(P<0.01)；細(xì)胞上清液TGFβ1濃度升高(P<0.01)。②與H組比較，RGZ干預(yù)組HK-2細(xì)胞恢復(fù)為多邊形或圓形，電鏡下微絨毛增多，線粒體數(shù)目增加，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少：FSP1、a-SMA mRNA和蛋白表達(dá)下降(P<0.05或0.01)，E-cadmRNA和蛋白表達(dá)增加(P<0.01)；細(xì)胞上清液TGFβ1濃度下降(P<0.05或0.01)。高濃度RGZ組較低濃度組FSP1、a-SMA

6、、E-cad的mRNA和蛋白表達(dá)變化更顯著(P<0.01)，TGFβ1濃度下降更明顯(P<0.01)。③與N組比較，H組HK-2細(xì)胞增殖更為明顯，24hr、48hr、72hr三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞增殖數(shù)量分別是N組的1.19倍、1.31倍、1.51倍(P<0.05或0.01)。與H組比較，RGZ干預(yù)后HK-2細(xì)胞增殖受到抑制(P<0.05或0.01)，48hr、72hr時(shí)間點(diǎn)高濃度RGZ組抑制細(xì)胞增殖能力較低濃度組更顯著(P<0.05)。

7、 第二部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：①與N組比較，D組大鼠尿pro增多、尿NAG酶升高、Scr增高、Ccr下降(P<0.01)；腎組織腎小管變性、間質(zhì)纖維化病變明顯；FSP1，a-SMA蛋白和mRNA表達(dá)水平上調(diào)(P<0.01)，CK-18蛋白和mRNA表達(dá)水平下調(diào)(P<0.01)，Col Ⅰ蛋白表達(dá)增加(P<0.01)。②與D組比較，R組尿pro減少、尿NAG酶下降、Scr降低、Ccr升高(P<0.01)；腎組織腎小管變性、間質(zhì)纖維化病變減輕；F

8、SP1，a-SMA蛋白和mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05或0.01)，CK-18蛋白和mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，Col Ⅰ蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。 結(jié)論： ①高糖刺激后的HK-2細(xì)胞和糖尿病腎病大鼠均出現(xiàn)腎小管細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，提示糖尿病腎病時(shí)存在EMT現(xiàn)象。 ②糖尿病腎病大鼠血尿生化指標(biāo)和Col Ⅰ表達(dá)的變化，提示腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化在促進(jìn)腎纖維化的發(fā)生、發(fā)展方面起了重要作用。