羅格列酮對(duì)糖尿病大鼠腎臟保護(hù)作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：糖尿病腎病(DN)是糖尿病重要的慢性微血管并發(fā)癥之一，其主要病理變化表現(xiàn)為腎小球、腎小管肥大，腎基底膜增厚、腎小球系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)堆積，其中Ⅳ型膠原(Col-Ⅳ)是ECM增殖的主要成分，是導(dǎo)致DN的主要病理基礎(chǔ)。羅格列酮(RSG)屬于噻唑烷二酮類藥物(TZDs)，是一種新型的口服抗糖尿病藥物，該類藥物是通過(guò)結(jié)合并激活核轉(zhuǎn)錄因子即過(guò)氧化物酶增殖體激活受體γ(PPARγ)，通過(guò)改善胰島素敏感性、降低胰島素抵抗而發(fā)揮作用。一些

2、臨床試驗(yàn)表明，RSG還可以顯著減少尿蛋白、血肌酐，改善腎臟損傷。近年認(rèn)為RSG尚有獨(dú)立于胰島素增敏/降血糖之外的腎臟保護(hù)作用。國(guó)外已有研究表明，PPARγ的激活可抑制視網(wǎng)膜、血管平滑肌及多種腫瘤細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞停滯在G0/G1期。RSG對(duì)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞的增殖是否也有抑制作用?其細(xì)胞和分子生物學(xué)機(jī)制尚未闡明。 本研究旨在通過(guò)觀察RSG對(duì)具有IR的2型糖尿病大鼠胰島素抵抗相關(guān)因素、腎臟組織病理的變化以及RSG對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠系

3、膜細(xì)胞增殖的影響，從體內(nèi)、體外兩方面，進(jìn)一步闡明DN發(fā)病機(jī)制及RSG對(duì)DN的影響，為阻止或延緩DN發(fā)生發(fā)展提供新的思路和實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括以下兩部分： 第一部分：動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 方法：通過(guò)喂養(yǎng)高熱量飲食并通過(guò)腹腔注射小劑量的鏈脲佐菌素(STZ)，建立具有IR的2型糖尿病大鼠模型，把糖尿病大鼠隨機(jī)分為糖尿病對(duì)照組(DM-C組)、糖尿病羅格列酮治療組(DM-R組)、糖尿病二甲雙胍對(duì)照組(DM-M組)。實(shí)驗(yàn)全程共持續(xù)18周，于

4、實(shí)驗(yàn)的4周、8周、18周末分別測(cè)量體重，測(cè)定空腹血糖(FBG)、血清胰島素(FIN)、血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、血清甘油三酯(TG)、血清總膽固醇(TC)水平，18周末代謝籠收集24小時(shí)尿液，測(cè)定尿白蛋白排泄率(UAER)；取腎臟進(jìn)行HE、PAS及免疫組化染色及電鏡觀察，觀測(cè)腎臟形態(tài)及病理變化，用免疫組化的方法檢測(cè)腎臟TGF-β1、ERK、c-fos的蛋白表達(dá)水平，反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)PPARγmRNA水平

5、。 結(jié)果1.糖尿病組大鼠喂養(yǎng)高糖高脂飲食4周后，其體重較正常對(duì)照組增加，差異有顯著性(P＜0.01)；血清TG、TC、HOMA-IR較正常對(duì)照組升高且差異具有顯著性(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01)；FBG與正常對(duì)照組相比升高但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，表明大鼠經(jīng)高糖高脂飲食喂養(yǎng)4周后誘導(dǎo)出胰島素抵抗。 2.糖尿病組大鼠腹腔注射小劑量STZ后4周，體重較正常對(duì)照組升高但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；血清TG

6、、TC較正常對(duì)照組升高且具有顯著性差異(P＜0.01，P＜0.01)；FBG較正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.01)；FIN較注射STZ前降低，但與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；HOMA-IR與正常對(duì)照組相比顯著升高(P＜0.01)，提示糖尿病組大鼠胰島素抵抗繼續(xù)存在，至此已成功建立具有高血糖、血脂異常、胰島素不低、胰島素抵抗等特點(diǎn)的2型糖尿病大鼠模型。 3.18周末實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，DM-C組大鼠腎重、腎重/體重較正常對(duì)照組增

7、加，且差異具有顯著性(P＜0.01，P＜0.01)；DM-R組和DM-M組腎重、腎重/體重較DM-C組減輕且具有顯著性差異(P＜0.01，P＜0.05；P＜0.01，P＜0.01)。DM-R組和DM-M組FBG、FIN水平較DM-C組降低差異具有顯著性(P＜0.05，P＜0.01；P＜0.01，P＜0.05)。DM-R組和DM-M組HOMA-IR較DM-C降低具有顯著性差異(P＜0.01，P＜0.05)。與DM-C組相比，DM-R組和D

8、M-M組血清TG水平下降，差異具有顯著性(P＜0.01，P＜0.05)。 4.DM-R組血清TGF-β1、尿白蛋白排泄率(UAER)較DM-C組降低且差異具有顯著性(P＜0.05，P＜0.05)；DM-M組UAER較糖尿病對(duì)照組差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。 5.DM-C組PPARγmRNA水平較正常對(duì)照組升高(P＜0.05)，TGF-β1、ERK、c-fos的蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.01，P＜0.01，P

9、＜0.01)。DM-R組TGF-β1、ERK、c-fos的蛋白表達(dá)較DM-C組降低差異具有顯著性(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05)，PPARγmRNA水平較DM-C組升高差異具有顯著性(P＜0.01)。 6.與正常組比較，光鏡結(jié)果：DM-C組腎小球肥大，基底膜增厚，系膜區(qū)基質(zhì)明顯增生，細(xì)胞增生。電鏡觀察：腎小球細(xì)胞基底膜不均勻增厚，相鄰足突大部分融合，內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)增多。兩治療組均較DM-C組有改善。 7.相關(guān)分

10、析顯示：HOMA-IR與腎重/體重、TG、血清TGF-β1、呈正相關(guān)(r=0.574，P＜0.05；r=0.775，P＜0.01；r=0.556，P＜0.05)；UAER與腎重/體重、TG、血清TGF-β1正相關(guān)(r=0.874，P＜0.01；r=0.596，P＜0.01；r=0.769，P＜0.01)；腎臟ERK、c-fos與TGF-β1的蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.656，P＜0.01；r=0.679，P＜0.01)。 結(jié)論

11、 1.SD大鼠經(jīng)高糖、高脂飲食誘導(dǎo)4周后出現(xiàn)高胰島素血癥、胰島素敏感性下降。在此基礎(chǔ)上，小劑量腹腔注射鏈脲佐菌素，損傷部分胰島β細(xì)胞，誘導(dǎo)出既有胰島素相對(duì)分泌障礙又有胰島素抵抗繼續(xù)存在的2型糖尿病大鼠模型。該模型具有高血糖、血脂異常、胰島素抵抗、典型腎臟病變等特點(diǎn)。與人類2型糖尿病合并糖尿病腎病的臨床特征類似，故此模型可用于2型糖尿病慢性并發(fā)癥的研究。 2.糖尿病腎病大鼠存在與胰島素抵抗相關(guān)的糖、脂代謝紊亂，糖尿病大鼠腎重

12、/體重、血清TG、TGF-β1的水平與HOMA-IR呈正相關(guān)，與UAER呈正相關(guān)；表明腎重/體重升高、血清TG、TGF-β1升高與胰島素抵抗的發(fā)生密切相關(guān)且均為DN的危險(xiǎn)因素；同時(shí)腎臟TGF-β1、ERK、c-fos的蛋白表達(dá)明顯增加且成正相關(guān)；表明TGF-β1、ERK、c-fos在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，且TGF-β1的表達(dá)升高與ERK-c-fos通路有關(guān)。 3.經(jīng)RSG和二甲雙胍治療，糖尿病大鼠的各種代謝紊亂明顯減

13、輕；腎臟病理?yè)p傷減輕，表明RSG和二甲雙胍可通過(guò)改善胰島素抵抗綜合征的多個(gè)成分而減少DN發(fā)生的危險(xiǎn)性。同時(shí)RSG還能減少糖尿病腎病大鼠腎臟TGF-β1、ERK、c-fos的蛋白表達(dá)及增加PPARγmRNA的表達(dá)；UAER明顯下降，表明RSG有獨(dú)立于改善胰島素抵抗綜合癥外尚可作用與DN發(fā)生有關(guān)的炎癥因子，該作用與激活PPARγ有關(guān)，而二甲雙胍無(wú)此作用，在DN治療方面RSG優(yōu)于二甲雙胍。 第二部分：細(xì)胞培養(yǎng) 方法：以大鼠腎小

14、球系膜細(xì)胞株HBZY-1為靶細(xì)胞，以羅格列酮鈉(RSGn)為刺激藥物，觀察不同濃度不同時(shí)間RSGn對(duì)高濃度葡萄糖(30mmol/L)培養(yǎng)的系膜細(xì)胞的作用，用細(xì)胞形態(tài)觀察、4-甲基偶氮四唑鹽(MTT)、流式細(xì)胞分析技術(shù)及酶聯(lián)免疫分析法，從細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞周期變化、Ⅳ型膠原(Col-Ⅳ)含量方面進(jìn)行研究。 結(jié)果 1.與正常濃度葡萄糖(5.6mmol/L)組比較，高糖組刺激24小時(shí)即可明顯促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖(P＜0.

15、05)，并且一直持續(xù)到72小時(shí)。200μmol/LRSGn作用24小時(shí)即出現(xiàn)抑制高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，作用48、72小時(shí)后RSGn組系膜細(xì)胞增殖顯著低于高糖刺激組(P＜0.05)，但72小時(shí)作用后RSGn組系膜細(xì)胞數(shù)量低于正常糖組，兩組之間有顯著性差異(P＜0.05)。100-400μmol/L藥物濃度范圍內(nèi)作用48小時(shí)，RSGn組系膜細(xì)胞增殖均顯著低于高糖刺激組(P＜0.05)，并呈劑量依賴關(guān)系。

16、 2.倒置顯微鏡觀察RSGn對(duì)高糖誘導(dǎo)的HBZY-1細(xì)胞的影響：未加RSGn處理的細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則，成多邊形，細(xì)胞間隙小且貼壁成團(tuán)生長(zhǎng)；RSGn干預(yù)后，細(xì)胞變小，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞團(tuán)內(nèi)相鄰細(xì)胞間間隙變大，細(xì)胞貼壁能力減弱；隨RSGn干預(yù)濃度的加大、作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)改變?cè)矫黠@。400μmol/LRSGn作用48小時(shí)，伴有大量的細(xì)胞脫壁死亡。 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)提示，100-400μmol/LRSGn作用48小時(shí)可阻止高糖誘導(dǎo)的

17、HBZY-1細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，隨RSGn濃度增大，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸增高，S期細(xì)胞比、PI值含量則逐漸下降，與高糖對(duì)照組比較有顯著性差異，而G2/M其細(xì)胞比變化不大。另外在RSGn作用的48小時(shí)過(guò)程中，并出現(xiàn)了指示細(xì)胞凋亡的亞G1期凋亡峰，提示RSGn對(duì)高糖誘導(dǎo)的HBZY-1細(xì)胞凋亡作用。 4.高糖組系膜細(xì)胞上清液中Col-Ⅳ含量明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，RSGn組上清液中Col-Ⅳ含量顯著低于高糖對(duì)照組(P