平頭炭疽菌、黑白輪枝菌、大麗輪枝菌及大豆根部病原菌的LAMP檢測.pdf

1、平頭炭疽菌（Colletotrichum truncatum）引起的大豆炭疽病是影響大豆生長的重要病害，每年對我國的大豆生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。黑白輪枝菌（Verticillium albo-atrum）和大麗輪枝菌（V.dahliae）能夠危害苜蓿、棉花等多種作物，是我國重要的檢疫性病原真菌。為提高對平頭炭疽菌、黑白輪枝菌和大麗輪枝菌的早期快速診斷技術(shù)水平，在病菌侵染初期準(zhǔn)確診斷出病原菌的存在，降低經(jīng)濟(jì)損失，本研究基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(l

2、oop-mediated isothermal amplification，LAMP)，分別建立了以下三種可特異性檢測平頭炭疽菌、黑白輪枝菌和大麗輪枝菌的LAMP技術(shù)體系。
　　第一章的研究基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)，以Rpb1(the large subunit ofRNA olpymeraseⅡ，RNA聚合酶Ⅱ大亞基)為靶標(biāo)基因，建立了平頭炭疽菌的LAMP檢測體系。反應(yīng)條件為62℃60min，反應(yīng)結(jié)束后在反應(yīng)管內(nèi)加入S

3、YBR GreenⅠ可直接判定結(jié)果，陽性反應(yīng)呈黃綠色，陰性反應(yīng)為橙色。該體系檢測的靈敏度為100 pg·μL-1。該技術(shù)體系可以直接對田間發(fā)病組織中的病原菌進(jìn)行檢測，應(yīng)用該技術(shù)我們成功且快速地對江蘇、安徽和湖北采集的發(fā)病大豆樣本和來自不同地區(qū)的大豆種子進(jìn)行了病害診斷和病原菌的檢測。
　　第二章的研究基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)，以Tub(β-tublin，β-微管蛋白)作為靶標(biāo)基因，建立了檢測黑白輪枝菌的LAMP體系。該方法

4、在62℃等溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)70 min，擴(kuò)增前加入染料HNB（羥基萘酚藍(lán)），反應(yīng)后可直接通過肉眼觀察顏色變化判定結(jié)果，陽性反應(yīng)呈天藍(lán)色，陰性反應(yīng)為紫色。該方法的最低檢測限為1 pg·μL-1，在土壤中的檢測靈敏度為10個孢子/0.25g土壤，在苜蓿種子中檢測的靈敏度為50個孢子/10 g種子。應(yīng)用該技術(shù)在采自新疆的7份苜蓿黃萎病疑似樣本中檢測到3份陽性。該方法的建立為黑白輪枝菌的檢驗檢疫及其所致病害的診斷提供了新的技術(shù)。

5、　　第三章的研究基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)，以Gpd(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，甘油醛-3-磷酸脫氫酶)基因作為靶標(biāo)基因，建立了一種基于顏色判定的簡單、快速和靈敏的大麗輪枝菌的檢測方法。該方法在62℃等溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)70 min，擴(kuò)增前加入染料HNB（羥基萘酚藍(lán)），反應(yīng)后根據(jù)顏色變化判定擴(kuò)增結(jié)果，陽性為天藍(lán)色，陰性為紫色。該方法的最低檢測限為100pg·μL-1，

6、在土壤中檢測的靈敏度為10個孢子/0.25 g土壤。該技術(shù)能夠檢測出棉花發(fā)病組織中的目標(biāo)菌，對采自江蘇和山東的24份疑似病害樣本進(jìn)行檢測，11份為陽性。該方法的建立為大麗輪枝菌的檢測及其所致病害的診斷提供了新的技術(shù)。
　　大豆根部病害是造成我國大豆生產(chǎn)中產(chǎn)量損失的主要因素。其病原菌種類復(fù)雜，病害癥狀相似，不易區(qū)別，給病害準(zhǔn)確診斷帶來困難。為了明確黃淮地區(qū)大豆根腐病病原種類及其致病優(yōu)勢種，本研究采用本實驗室研發(fā)的分別針對尖鐮孢菌(F

7、usariumoxysporum)、木賊鐮孢菌（F.equiseti）、層出鐮孢菌（F.proliferatum）、黃色鐮孢菌（F.culmorum）、禾谷鐮孢菌(F.graminearum)、茄腐鐮孢菌（F.solani）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、大豆炭腐病菌(Macrophomina phaseolina)、冬青麗赤殼菌（Calonectria ilicicola）和大豆疫霉菌(Phytophthora

8、sojae)的10個LAMP檢測體系對采自山東省、江蘇省、安徽省的165份大豆根部病害樣本進(jìn)行檢測。LAMP檢測結(jié)果顯示，上述10種病原菌的檢出率依次分別為26％、28％、12％、18％、13％、16％、17％、8％、38％和44％;黃淮地區(qū)大豆根部病害由病原菌復(fù)合侵染引起是一種普遍現(xiàn)象，復(fù)合侵染病害樣本比率占所檢測陽性病害樣本的75％，多數(shù)由2種或3種病原菌復(fù)合侵染引起。大豆疫霉菌和冬青麗赤殼菌為引起該地區(qū)大豆根腐病的優(yōu)勢種群。本研究