大麗輪枝菌DNA甲基化酶基因VdDIM-2的克隆及功能分析.pdf

1、大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）是引起棉花黃萎?。╒erticilliumwilt）的主要致病菌之一，嚴重影響棉花質(zhì)量和產(chǎn)量，對世界各大產(chǎn)棉國造成不可預計的經(jīng)濟損失。該菌通過土壤進行傳播，寄主范圍多達660種植物，因其對環(huán)境適應性強，變異性大而快，且致病機理復雜等特點，加大了對棉花黃萎病的防治難度。大麗輪枝菌在寄主侵染的過程中，需要分化產(chǎn)生分生孢子，然后由分生孢子通過維管束對寄主植物進行系統(tǒng)的侵染。研究發(fā)現(xiàn)，強致病

2、力大麗輪枝菌比弱致病力大麗輪枝菌產(chǎn)生更多的分生孢子，分生孢子的分化能力在大麗輪枝菌致病性中起了重要的作用。
　　DNA甲基化酶DIM-2對模式菌株稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的產(chǎn)孢量起重要調(diào)控作用，并且參與病原菌侵染所必需的附著胞的分化過程；其基因缺失突變體菌株的致病力有所下降。模式菌株稻瘟病菌的研究思路和結(jié)果，可用來指導大麗輪枝菌的相關研究。以稻瘟病菌中編碼DIM-2的序列MGG_00889為源序列，利用BL

3、ASTP程序?qū)Υ篼愝喼蚪M數(shù)據(jù)庫進行序列相似性搜索，發(fā)現(xiàn)存在同源基因VDAG_00829。借助高效的基因敲除體系，構(gòu)建大麗輪枝菌VdDIM-2基因缺失突變體，然后觀察突變體的表型、生長速率以及產(chǎn)孢量，并與野生型菌株相比較，以期探索 DNA甲基化酶的缺失對大麗輪枝菌的形態(tài)及產(chǎn)孢量影響，試圖在表觀遺傳水平為防治棉花黃萎病提供潛在的理論依據(jù)。
　　結(jié)果顯示該菌株在PDA培養(yǎng)基、CPK培養(yǎng)基和果膠培養(yǎng)基上的生長速率與野生型菌株Vd99

4、1相近，且菌落形態(tài)無明顯變化。通過分析查比克培養(yǎng)基中兩種菌液的產(chǎn)孢量，發(fā)現(xiàn)Vd991與?VdDIM-2的產(chǎn)孢量高峰均在搖瓶培養(yǎng)后第6天，且產(chǎn)孢量沒有明顯的區(qū)別。對突變體菌株?VdDIM-2的致萎能力進行測試，通過計算棉花病情指數(shù)發(fā)現(xiàn)：在發(fā)病15天后野生型菌株Vd991和突變體菌株?VdDIM-2的病情指數(shù)分別為34.6和28.2；在發(fā)病25天后野生型菌株和突變體菌株的病情指數(shù)分別為56.5和50.8。以上實驗結(jié)果表明突變體菌株?VdDI