LPS和熱應(yīng)激對豬顆粒細(xì)胞的影響及HSP70參與調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、在眾多影響動(dòng)物繁殖的環(huán)境因素中，內(nèi)毒素（Endotoxin）感染和熱應(yīng)激（Heat stress）是兩個(gè)非常重要的方面。內(nèi)毒素化學(xué)本質(zhì)是脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）。LPS和熱應(yīng)激都能夠通過多種路徑對動(dòng)物機(jī)體造成不良影響，本研究著重探討二者對動(dòng)物繁殖產(chǎn)生的不良影響。已有研究結(jié)果證明，LPS或熱應(yīng)激作用于活體動(dòng)物時(shí)，均能顯著抑制生殖內(nèi)分泌軸，抑制激素分泌、發(fā)情、排卵，降低受胎率和活胎率等。卵泡顆粒細(xì)胞（Granu

2、losa Cell）是一種高度分化的體細(xì)胞，與卵母細(xì)胞關(guān)系密切，在動(dòng)物繁殖活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，而關(guān)于LPS和熱應(yīng)激對顆粒細(xì)胞的直接影響及作用機(jī)理仍缺乏深入了解。因此，本研究以離體培養(yǎng)的豬顆粒細(xì)胞為模型，旨在探討LPS和熱應(yīng)激對顆粒細(xì)胞形態(tài)、增殖、凋亡和激素分泌功能的影響，并對作用路徑進(jìn)行初步研究。
　　經(jīng)過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定LPS實(shí)驗(yàn)處理時(shí)間為48h，熱應(yīng)激處理實(shí)驗(yàn)為3h。利用掃描電子顯微鏡分別放大1000×、5000×、10000×

3、和15000×觀察LPS或熱應(yīng)激對細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生的影響。在LPS對顆粒細(xì)胞增殖、凋亡和雌激素分泌影響的研究中，利用CCK8測定細(xì)胞增殖情況；利用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒借助流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況；利用ELISA法測定培養(yǎng)液中E2含量，利用Western Blot檢測細(xì)胞MAPKs蛋白含量，包括ERK、Phospho ERK、JNK、Phospho JNK、p38、Phospho p38 MAPK；利用qRT

4、-PCR檢測與細(xì)胞增殖周期相關(guān)的基因FN1、IGF2、IGFBP2、Cyclin D1、Cyclin D2和P27kip的表達(dá)。針對LPS和熱應(yīng)激對顆粒細(xì)胞功能的影響檢測了基因P450arom、FSHR的表達(dá)。同時(shí)檢測了HSP70基因的表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)，LPS和熱應(yīng)激都能夠激活顆粒細(xì)胞HSP70基因，使這兩個(gè)環(huán)境不良因素對動(dòng)物繁殖影響產(chǎn)生交匯點(diǎn)，因此利用小分子物質(zhì)HSP70抑制劑（VER155008）和HSP70激活劑（STA-4783）

5、針對HSP70作相應(yīng)處理，隨后分別檢測三個(gè)基因的表達(dá)和HSP70蛋白的表達(dá)。并在HSP70過表達(dá)的基礎(chǔ)上利用Western Blot和細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)對Phospho Smad3進(jìn)行了定量和定位。
　　結(jié)果顯示LPS處理后，細(xì)胞飽滿，有較多微絨毛發(fā)和偽足，細(xì)胞狀態(tài)和活力均優(yōu)于對照組。1000ng·mL-1濃度LPS即可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、提高活細(xì)胞百分率（P<0.05），而500ng·mL-1 LPS即可促進(jìn)與細(xì)胞

6、生長增殖、周期相關(guān)基因FN1（P<0.01），IGF2、IGFBP2（P<0.05），Cyclin D1、Cyclin D2（P<0.01）的表達(dá)，抑制阻礙細(xì)胞周期的基因P27kip（P<0.01）的表達(dá)。細(xì)胞MAPKs蛋白含量中，各總蛋白含量不變，各磷酸化蛋白含量增加。熱應(yīng)激處理使細(xì)胞固縮，微絨毛及偽足消失，細(xì)胞狀態(tài)比對照組差。LPS和熱應(yīng)激均可強(qiáng)烈抑制芳香化酶P450arom和FSHR基因的表達(dá)（P<0.01），LPS刺激還能夠顯著

7、抑制E2的分泌（P<0.01）。LPS和熱應(yīng)激均可在轉(zhuǎn)錄和反應(yīng)水平上顯著地上調(diào)HSP70基因的相對表達(dá)量（P<0.01）。經(jīng)HSP70抑制劑（VER155008）處理后，HSP70基因相對表達(dá)量代償性上調(diào)，蛋白表達(dá)量被抑制。P450arom和FSHR基因的相對表達(dá)量顯著回調(diào)（P<0.01）。在應(yīng)用HSP70激活劑（STA-4783）后，HSP70基因被極顯著激活（P<0.01），基因相對表達(dá)量增加超過50倍，蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)。P450